[发明专利]一种用于长期保存成体干细胞的冻存液

说明书

技术领域

本发明属于细胞组织工程领域，涉及一种用于长期保存成体干细胞的冻存液。

背景技术

淫羊藿总黄酮(EF)是中药的提取物，可促进干细胞的增殖、迁移和抗氧化能力。采用基因芯片技术发现EF对皮质酮大鼠生长激素(GH)、生长激素释放激素(GHRH)及各类促生长因子如胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)、神经生长因子(NGF)等具有显著上调作用。在自然衰老大鼠(肾虚证模型)发现EF能使多个组织的基因表达年轻化，也使老年大鼠下调的GH、GHRH及IGFBP、NGF等的表达上调。采用体外分离的胚鼠神经干细胞进一步证明淫羊藿及其提取物对干细胞具有直接促增殖、抗凋亡作用。此外，有报道表明淫羊藿总黄酮的抗氧化作用对急性冷暴露小鼠组织损伤有修复作用。

目前，低温保存干细胞主要依靠抗冻液二甲基亚砜(DMSO)(SIGMA，D5879)

和血清的保护。而二甲基亚砜对细胞有损伤，且复苏过程中容易导致干细胞氧化损伤与分化潜能降低。

发明内容

为了解决现有细胞冻存液中保护成分单一等问题，本发明应用淫羊藿总黄酮(西安草根生物工程有限公司，20100806)为添加剂，以Knock-out血清(Gibco，10828028)替代常规胎牛血清，提高成体干细胞复苏后的抗凋亡、抗氧化能力，且去除外源动物源血清对细胞的影响。

本发明采用以下技术方案：

本发明的长期保存成体干细胞的冻存液采取以下方法制备，包括以下步骤：

按二甲基亚砜∶血清∶DMEM培养基比例为1∶2∶7浓度配置基础冻存液；

淫羊藿总黄酮冷冻液的配制：将1mg淫羊藿总黄酮加入10ml的DMEM培养液中，配制成105ng/ml的母液，再取母液1ul稀释到10ml上述基础冻存液中，即得所需终浓度为10ng/ml的冻存液。

具体实施方式

基础冻存液的配置：

冻存液配置顺序：DMEM培养基中先添加二甲基亚砜，再加入Knock-out血清；

配置比例：DMEM培养基、二甲基亚砜、血清按7∶1∶2比例配置基础冻存液；

淫羊藿总黄酮冷冻液的配制：

将1mg淫羊藿总黄酮加入10ml的基础冻存液中，配制成105ng/ml的母液；

再取母液1ul稀释到10ml上述基础冻存液中，即得所需终浓度为10ng/ml的冻存液。

细胞冻存：

细胞经1000rpm，10min离心倒掉上清液，用含淫羊藿总黄酮的冻存液重悬，装入无菌细胞冻存管中。

冻存程序：

放入细胞程序性冷冻盒，-80℃放置12h后放入液氮长期保存。

4℃条件下放置30min，-20℃放置2h，-80℃放置16-18h后直接放入液氮长期保存。

细胞复苏：

冻存管从液氮取出后，在37～40℃水域中迅速搅动至溶解，加入DMEM培养基，1500rp离心10min，弃上清，置37℃、5％CO2培养箱中培养。

台盼兰染色计数细胞活性率(见表1)。

表1.骨髓间充质干细胞复苏后活性比率