[发明专利]一种快速测定海洋双壳贝类总抗氧化能力的方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种测定海洋贝类抗氧化能力的方法，具体说是一种快速测定海洋双壳贝类总抗氧化能力的方法。

背景技术

总抗氧化能力(Total antioxidant capability，TAC)是衡量动物清除机体内过量的活性氧自由基（Reactive oxygen radical species, ROS）的能力，是一个综合性指标。在疾病和应激状态下，动物机体需氧量会急剧增加、代谢异常，引起氧化应激，细胞内会产生和积累大量的ROS。ROS通过与蛋白质、核酸和脂类发生作用而引起蛋白质失活甚至降解、DNA链发生断裂、脂质过氧化等，从而导致细胞结构和功能破坏，同时引发体内氧化胁迫，若不能及时清除，最终造成机体氧化损伤，严重危害机体健康，甚至导致死亡。正常情况下，细胞内ROS的产生与清除总是处于动态平衡状态。在生物系统进化过程中，动物细胞为了保护自身免受伤害也形成了一套由抗氧化酶体系（如超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化氢酶GPx等）和抗氧化非酶体系（如类胡萝卜素、辅酶Q、硒、维生素、含巯基化合物等）内在的抗氧化防御体系，从而具有一定的抗氧化能力。因此，研究机体清除ROS的能力对其维持内环境稳定和抗逆抗病能力具有重要意义。

海产双壳类是软体动物门中最重要的一个纲，其中有很多种类，如蚶、蛤、扇贝、蛏等不但具有重要的经济价值，同时也是重要的海水养殖对象。然而，迄今为止，对这些物种抗氧化能力的研究却知之甚少，仅在贻贝、蛏等个别种类上有少量的报道，而且其测定方法都是采用铁离子还原抗氧化力分析法（Ferric reducing antioxidant power，FRAP）处理样品后，利用分光光度计来进行。这种常规的方法有几个缺点：1、耗时长。在样品处理完成后，每个样品仍需1分钟；2、用样量多。每次需要用的样品量至少2ml；3、重复性差。由于样品在空气中暴露时间长，样品重复测量值间的变化较大；4、实用性弱。每次只能够测定单个物种或少数物种，不能够批量测定、实用性弱。这种常规测定TAC的方法已远远不能满足种类繁多的海产双壳贝类科学研究的需要，因此，必须建立一种快速测定TAC的方法。迄今为止，尚未见到任何有关快速测定海产双壳贝类体内总抗氧化能力方法的报道。

发明内容

本发明的目的为了提供一种用样量少、重复性好、实用性强且快速的测定海产双壳贝类总抗氧化能力的方法。

本发明利用96孔酶标板的全波频扫描型酶标仪代替分光光度计测定处理后样品的总抗氧化能力，能够在极短的时间内，对批量样品进行快速、准确的测定，从而为海产双壳贝类的种间抗性研究提供一个快速检测方法。

本发明的技术方案是：利用FRAP法处理不同海产双壳贝类的不同组织，获得待测样品的上清液后，利用全波频扫描型酶标仪对其总抗氧化能力进行快速测定，其操作步骤为：

1、建立Trolox标准曲线：①精确称取Trolox [(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid]，用95%乙醇配制母液，并稀释成梯度浓度，然后取等量加入不同的试管中再分别加入3倍和30倍的蒸馏水和FRAP工作液（0.3M醋酸盐缓冲液: 10 mM TPTZ溶液: 20 mM FeCl₃溶液 = 10: 1: 1比例混合，用前半小时临时配制）建成Trolox反应体系，同时以95%乙醇代替Trolox溶液作为对照；②37℃水浴30 min后，立即以冰水浴终止反应。③然后吸取每份混合物200 μl，用全波频扫描型酶标仪在593 nm处测定其吸光值并计算出标准曲线。

2、建立蛋白质定量标准曲线：①精确称取标准牛血清蛋白，用蒸馏水配制母液，并稀释成梯度浓度，然后取等量加入不同的试管中再加入5倍体积的0.1g/L考马斯亮蓝-G250染液；②混匀并静置5min，然后吸取每份样品200 μl，用全波频扫描型酶标仪在595 nm处测定其吸光值并计算出标准曲线。

3、组织取样：分别对活的双壳海产贝类的闭壳肌、鳃、外套膜等组织进行取样，并以预冷的生理盐水（0.86％）清洗所取组织样品，整个过程在冰上进行。

4、样品处理：各组织样品初步粉碎并搅拌均匀后，分别称取一定量的组织样品于离心管中，加入体积为样品质量9倍的PBS缓冲液，在冰水浴条件下以10000-15000 r/min转速进行匀浆。之后以12000 g于4℃下离心10 min，取上清液并稀释到所需的浓度后备用。