[发明专利]球形棕囊藻培养液的除菌方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微藻培养液，尤其是涉及一种球形棕囊藻培养液的除菌方法。

背景技术

在赤潮的微生物防治研究领域中，藻液中细菌的存在对不可培养的溶藻微生物的纯化，以及溶藻微生物和杀藻物质的杀藻机制的研究带来了极大困难，因此希望能够通过对藻液进行除菌处理来排除藻际环境细菌的干扰。

目前报道的藻液除菌方法主要有：①显微镜下挑取单个藻细胞，用无菌的藻培养基进行反复洗涤，然后接种于藻培养基中，该法操作较为麻烦，需要一定的藻类分离经验，同时单个藻细胞的培养难度较大；②利用化学物质杀灭细菌，包括十二烷基磺酸钠(SDS)等去垢剂，但化学物质同时也会对藻造成伤害；③利用抗生素特异性的杀死细菌，这是最为简便且广泛使用的方法，其缺点是不同抗生素其作用的细菌不同，有些抗生素并不能完全杀死细菌，有些抗生素同时也会对藻造成伤害。

为了测定SDS和抗生素对藻的抑制作用，需要一种快速而准确的藻细胞密度测定方法。目前藻细胞计数的方法主要有(1.胡先文，董元彦，张新萍，叶发兵，可见分光光度法测定水华鱼腥藻.华中农业大学学报，2002(03)：295-297；2.侯建军，黄邦钦，戴相辉，赤潮藻细胞计数方法比较研究.中国公共卫生，2004(08)；3.董正臻，董振芳，丁德文，快速测定藻类生物量的方法探讨.海洋科学，2004(11)：1-2，5；4.Imai，I.，Y.Ishida，K.Sakaguchi，Y.Hata，Algicidal marine bacteria isolated from northern Hiroshima Bay，Japan.Fisheries science.Tokyo，1995.61(4)：628-636)：光学显微镜直接计数法、可见光分光光度法、荧光分光光度法、叶绿素a测定法、流式细胞计数法、库尔特计数法和活体荧光检测技术等。显微计数法工作量大，人为误差也较大；叶绿素a含量测定法耗费时间长；流式细胞计数法样品需经过一定的前处理，摸索出适合的仪器参数，同时流式细胞仪价格也较昂贵；库尔特计数线性范围较小，适用于藻密度较小时；活体荧光检测技术一次只能对一个样品进行测定，多样品时更换样品的操作同样繁琐。

利用酶标仪进行测定的荧光光度法和分光光度法一次可以测定96个样品，满足快速测定的要求。SDS裂解细胞后产生的白色沉淀对吸光值的影响较大，对荧光值影响较小，且用荧光光度法测定的SDS处理藻液的藻细胞密度结果与肉眼观察结果一致；抗生素处理藻液后不产生白色沉淀，不会干扰吸光值，且用分光光度法测定的抗生素处理藻液的藻细胞密度结果与肉眼观察结果一致；因此本发明分别选用荧光光度法和分光光度法测定SDS和抗生素处理藻液的藻细胞密度。

此外，在各种除菌方法中，最重要的一步是如何以有效、准确、可靠的手段来证实所获得的体系内是否真的无菌。报道的许多方法只是利用各种培养基进行细菌培养实验，一旦发现没有细菌生长，就认为是无菌的，考虑到大多数的微生物都是未可培养的，这个检验结果并不可信；另外还有报道分别利用表面荧光显微镜观察以及对真细菌和古细菌16S rDNA进行特异性扩增来检验细菌是否存在(5.Su，J.Q.，X.R.Yang，T.L.Zheng，H.S.Hong，An efficient method to obtain axenic cultures of Alexandrium tamarense--a PSP-producing dinoflagellate.Journal of Microbiological Methods，2007.69(3)：425-430.)。在前期实验中，我们发现真细菌16S rDNA保守性引物可以扩增出球形棕囊藻的线粒体DNA片段，因此不能用该方法来检测藻液中是否有菌存在。于是本发明同时利用微生物培养和表面荧光显微镜观察的方法来检测经除菌处理的藻液及其传代藻液中是否有菌存在，两种检测方法一起使用使检验结果更准确、可靠。

发明内容

本发明的目的是提供一种球形棕囊藻培养液的除菌方法。

本发明的具体步骤是：

1)取生长至对数期的藻液，离心，去上清；

2)用f/2培养基重悬藻细胞，离心，去上清，重复此步骤2次，然后用f/2培养基重悬藻细胞；

3)加入SDS和8种抗生素，所述8种抗生素为克林霉素、阿奇霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、头孢霉素、氨苄青霉素和利福霉素；