[发明专利]一种用金磁微粒纯化植物组织基因组DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用金磁微粒纯化多种类型植物及不同部位的植物组织基因组DNA的方法。

背景技术

利用带有目的基因的供体植物DNA直接转化受体，筛选目的性状变异后代，是植物基因工程与分子生物技术在农业上的实际应用。从不同种属的植物及其不同部位提取出质量较高的基因组DNA进行后续的PCR反应等下游实验是一个关键环节，建立的方法对提取得到的基因组DNA的纯度及浓度有较高要求。目前，植物组织基因组DNA提取方法都有很强的针对性，而且大都只能从新鲜的植物叶片中提取，这样以来会对下游应用带来很大的局限性。

核酸纯化方法大体上可分为两种，一种是酚氯仿抽提液相纯化法，一种是固相纯化法。酚氯仿抽提法主要通过有机相-水相分配来除去杂质达到纯化核酸的目的。固相纯化法则通过核酸与固相介质的非特异可逆性结合，从而达到纯化核酸的目的，其结合方式主要包括吸附结合和离子交换结合。

传统的几种植物基因组DNA提取方法存在一些缺点。如CTAB法和SDS法需要酚氯仿反复抽提与离心，耗费大量的时间，人力、物力。此外，现有的植物基因组DNA纯化的文献报道基本上都是针对某种植物的新鲜叶片，如针对烟草的叶片、番茄叶片等开发的有针对性的方法。因为不同植物的组织或同一植物的不同组织材料，由于其化学成分、组织结构等差异，在提取基因组DNA时需选择不同的方法或作一些特殊的处理，这为实验带来极大的不便。因此，研究通用、快速适于植物不同部位组织基因组DNA的方法也非常重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用磁性纳米复合材料进行简便、快速纯化植物组织基因组DNA的方法，以解决背景技术操作复杂、纯化率低、不具有通用性等问题；可适用于纯化不同植物的组织及同一植物不同组织。

本发明的技术方案：

一种用金磁微粒纯化植物组织基因组DNA的方法，包括以下步骤：

1)制备含有基因组DNA的样品裂解液

取植物组织样本，分别加入100～800μl的两种裂解液，其中第一种裂解液中含有质量体积比为2％～5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和体积分数为0.5％～2％β-巯基乙醇，第二种裂解液中含有3～6M盐酸胍、体积分数为2％～5％Triton X-100；混匀后于水浴中充分裂解5～30min，再加入10～50μl的10mg/ml RNase溶液，得到含有基因组DNA的样品裂解液；(“质量体积比”的单位即g/ml，表示溶质的质量与该种裂解液的体积的比)

2)用氯仿抽提后离心

用0.6ml～1.2ml氯仿在所述样品裂解液中进行样本抽提，然后8000rpm～13000rpm离心5min，得到含有基因组DNA的上清；

3)结合

取400～1000μg金磁微粒与含有基因组DNA的上清混合，在结合缓冲液的作用下，形成含有金磁微粒-基因组DNA复合物的溶液；

4)清洗

对含有金磁微粒-基因组DNA复合物的溶液进行磁性分离，弃去上清液，再加入清洗液混匀，磁性分离，弃上清，得到金磁微粒-基因组DNA复合物；

5)洗脱

将洗脱液与金磁微粒-基因组DNA复合物混匀，使基因组DNA从金磁微粒上转到洗脱液中，磁性分离直至上清澄清，收集上清液，所得上清液即为纯化得到的基因组DNA溶液。

上述步骤1)中所述第一种裂解液中含有质量体积浓度为2％～5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和体积分数为0.5％～2％β-巯基乙醇，第二种裂解液中含有3～6M盐酸胍、体积分数为2％～5％Triton X-100以及0.005～0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5～2M NaCl和0.05～0.2M Tris-HCl。

上述步骤3)中的结合缓冲液优选聚乙二醇与氯化钠的混合溶液，其中氯化钠的终浓度为1M～3M，聚乙二醇(PEG)的分子量在6000～10000之间，浓度为10％～30％；也可以选择公知的其他结合缓冲液。

上述步骤5)中所述洗脱液优选含有10mM Tris-HCl和1mM EDTA、pH＝8.0的TE溶液或无核酶水。

上述步骤2)采用氯仿只需进行一次样本抽提。

上述步骤4)中所述清洗液可以采用50％～85％的乙醇。

上述步骤1)中所述水浴的最佳温度为50～65℃。

本发明通过采用两种裂解液搭配使用，无需分步裂解组织，极大程度的满足对多种植物及其不同部位基因组DNA的提取。