[发明专利]荠菜冷调节蛋白基因启动子及其在植物抗寒性改良中的应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学、植物基因工程技术领域，具体涉及植物逆境诱导启动子的克隆及其应用。

背景技术

低温寒害是农林业生产中一种严重的自然灾害，世界每年因此造成的损失十分巨大，据统计达2000亿美元。自然环境下温度是决定植物地域分布的主要限制因子，在栽培条件下更影响着农作物及园艺植物等的产量和品质。温度作为重要的环境因子之一，限制植物的分布及生长和产量，对植物生长发育起着决定性作用（Viswanathan C, Zhu JK. Molecular genetic analysis of cold-regulated gene transcription. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2002, 357(1423):877-886）。随着转基因技术的日益成熟，人们已从植物中分离了大批抗寒相关基因（蔺忠龙等. 植物抗冻基因最新研究进展, 北方园艺, 2009(1):119- 123）用于抗寒植物的培育。但利用抗寒相关基因进行转基因抗寒植物培育时均发现在获得优良低温抗性植株的同时，普遍出现不同程度的生长延滞（retardation）现象。主要是利用抗寒相关基因进行的转基因植物都是在组成性启动子CaMV（cauliflower mosaic virus）35S驱动下产生的。这种基因的组成性表达对植物的生长造成了一定的影响。为了克服转基因植物出现的生长延滞现象，人们开始利用冷诱导启动子代替组成性启动子。冷诱导基因RD29A（来源于拟南芥COR78基因）启动子驱动的转基因植株的研究表明，转基因植株的生长延滞比CaMV35S启动子驱动的转基因植株所表现出来要轻微得多（Kasuga M, et al. A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress-inducible RD29A promoter improved drought and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Phsiol, 2004, 45:346-350）。利用特异性的诱导型启动子避免外源基因在宿主植物中非特异性的持续、高效表达已经得到广泛共识，但是真正能应用于生产实际的特异性启动子不多，而冷诱导型特异启动子更少。目前特异启动子的克隆及其结构功能的研究是转基因植物研究中的一个热点，也是一个生发点。这一领域的研究成果将极大推动转基因植物基础研究的进展，加速转基因植物的产业化。

荠菜（Capsella bursa-pastoris）是一种1或2年野生的草本植物，平铺地面，喜阴，在南方是处处可见的一种可食用的蔬菜，属于十字花科、荠菜属Capsella Medik，在低温条件下能够正常生长发育并结实。早期的研究表明，拟南芥中的冷调节蛋白（cold-regulated, COR）基因是一种诱发基因，只有在特定的条件下（如零上低温），COR基因才被启动进而促进细胞产生抗冷力。过表达COR15a基因的拟南芥比野生型的植株的抗寒性也有显著提高（Artus NN, et al. Constitutive expression of the cold-regulated Arabidopsis thaliana COR15a gene affects both chloroplast and protoplast freezing tolerance. PNAS, 1996, 93:13404-13409）。拟南芥中COR基因有两个拷贝，分别称为AtCOR15a和AtCOR15b，这两个基因串联排列在拟南芥第二条染色体上。研究表明AtCOR15b对低温和外源施加的ABA有强烈响应，而对干旱不响应（Kathy S. et al. Arabidopsis thaliana corl5b, an apparent homologue of corl5a, is strongly responsive to cold and ABA, but not drought. Plant Mol Biol, 1993, 23: 1073-1077）。本发明所涉及的荠菜冷调节蛋白基因的启动子与拟南芥中的AtCOR15b同源，属于COR15b型，命名CbCOR15b，是从荠菜叶片的DNA中克隆到的。目前尚未发现CbCOR15b启动子序列和利用CbCOR15b启动子培育耐寒植物的相关报道。