[发明专利]克隆青虾CHH基因的引物组及克隆青虾CHH基因的方法

说明书

  

技术领域

发明涉及CHH基因，具体地说是一种青虾（Macrobrachium nipponense）CHH基因和编码蛋白及其克隆方法。 

背景技术

CHH家族激素在调控甲壳运物的蜕皮、变态发育、生殖、血糖平衡以及体内的渗透压等方面起着重要的作用。 

甲壳类高血糖激素(Crustacean hyperglycemic hormone，CHH)是CHH家族的一员，可以通过调控磷酸化酶、糖原合成酶以及中肠淀粉酶活性使无眼柄的甲壳动物血糖增加，CHH根据内部信号如血淋巴中葡萄糖量，外部信号如缺氧、寄生虫感染、热激、污染物等做出反应。除了糖代谢外，CHH也参与脂代谢(Santos等，1997)、控制鳃的离子转运(Pienot等，2000)以及调节渗透压。 

研究表明，克氏原鳌虾(Procambarus clarkii)的CHH异构体对大颚器官MF的合成具有抑制作用(Laufer等，1994)，同样无缘蜘蛛蟹(Libinia emarginata)的CHH异构体也对MF的合成也具有调节作用(Liu等，1997)。 

许多证据显示CHH对生殖具有促进作用：Tensen等(1989)利用异源体内生物活性检测的方法，发现美洲鳌龙虾(Homarus americanus)的两种CHH-B的异构体对来自无常小长臂虾(Palaemonetes varians)的非卵黄发生期的卵细胞的生长具有促进作用，另外在同源体外生物活性检测中也发现两种CHHB异构体对生殖具有促进作用(Van Herp，1992)。雌性美洲鳌龙虾卵黄发生前期CHH-A与CHH-B的mRNA水平及眼柄中CHH的浓度显著变高，在卵成熟过程中，血淋巴中的CHH-A与CHH-B浓度亦变高，而GIH浓度变高的阶段则出现在卵黄发生前期及未成熟期。这一结果表明，CHH-A与CHH-B对卵黄发生起着激发作用，GIH则对卵黄发生起着抑制作用。 

甲壳类高血糖激素(Crustacean hyperglycemic hormone，CHH)，是甲壳动物眼柄中含量最丰富且被研究的最多的激素。目前关于青虾CHH的研究尚未进行。因此，本发明以青虾眼柄为材料，分离了青虾CHH的全长cDNA序列，并对其所编码的神经肽的序列特征、同源性、进化地位进行了分析，为全面掌握其生理功能提供了基础资料，为进一步研究青虾CHH基因的表达、调控奠定了基础，同时也为甲壳动物整个CHH家族的功能和进化研究提供了新的材料。 

发明内容

有鉴于此，本发明提供克隆青虾CHH基因系列的引物组和编码蛋白及其克隆方法。利用本发明提供的引物组首次从青虾眼柄中克隆到了一种CHH基因，为进一步研究CHH基因参与血糖调节、脂代谢、离子转运、渗透压以及促进卵黄生成作用等奠定基础，为青虾繁殖生理功能研究提供参考。 

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： 

本发明提供了扩增青虾AST基因全长cDNA序列的引物组，其由如下引物组成：

引物组1：

正向引物FS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

反向引物RS4的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

引物组2：

正向外引物FC3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

正向内引物FC3-3的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

反向外引物3′ RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

反向内引物3′ RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

引物组3： 

正向外引物RC5-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

正向内引物RC5-3的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

反向外引物5′ RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

反向内引物5′ RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

本发明还提供了一种克隆青虾CHH基因全长序列的方法，包括如下步骤： 

步骤1：从青虾眼柄中提取总RNA；

步骤2：然后RT进行cDNA 第一链合成；