[发明专利]青虾KSPI基因、其扩增方法及扩增引物组

说明书

技术领域

本发明涉及基因克隆领域，特别涉及青虾KSPI基因、其扩增方法及扩增引物组。

 

背景技术

丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serine proteinase inhibitor，SPI)是一类广泛存在于各种生物体内的蛋白，在变态、伤口愈合、先天免疫等过程中具有重要的作用。丝氨酸蛋白酶抑制因子主要包括serpin、α-巨球蛋白、Kazal型、Kunitz型等抑制因子家族，其中Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子(Kazal-type serine proteinase inhibitor，KSPI)是研究最广泛的酶抑制因子家族之一。KSPI最早发现于哺乳动物，随后又在克氏原鳌虾(Procambarus clarkii)、南美白对虾(Litopenaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、弓形虫(Toxoplasma gondii)和家蚕(Bombyx mori)等多种动物中被鉴定。KSPI在抗凝血、调控自我吞噬和机体防御等过程中具有重要的作用。最近研究发现，KSPI在生殖方面有着重要的功能。Li等在罗氏沼虾的研究中发现，KSPI能够抑制生殖腺中精子明胶酶的活性，推测KSPI可能在罗氏沼虾生殖过程中发挥某种重要作用。Jalkanen等在小鼠的研究中发现，KSPI对小鼠精子的成熟起调节作用。

青虾(Macrobrachium nipponense)是我国重要的淡水养殖经济品种。目前青虾的分子研究多集中在群体遗传多样性方面，其基因克隆研究较少，而对青虾KSPI基因克隆的研究尚未见报道。本研究拟以青虾为实验材料，根据本实验室青虾精巢cDNA文库中筛选到的一个KSPI基因片段，通过RACE技术克隆出该基因全长cDNA序列，以期为后续青虾KSPI基因功能的研究奠定基础, 同时为甲壳类生殖研究积累背景资料。

 

 发明内容

有鉴于此，本发明提供青虾KSPI基因、其扩增方法及扩增引物组。利用本发明提供的引物组从青虾精巢组织中克隆到了KSPI基因序列，对青虾KSPI基因功能的研究奠定基础，同时为甲壳类生殖研究积累背景资料。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了青虾KSPI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了用于扩增青虾KSPI基因的引物组，其由如下引物组成：

引物组:

正向外引物3 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

正向内引物3 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

反向外引物5 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

反向内引物5 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明还提供了一种扩增青虾KSPI基因的方法，包括如下步骤：

步骤1：获得青虾脑组织总RNA；

步骤2：合成cDNA；

步骤3：从本实验室构建的青虾精巢cDNA文库中筛选到KSPI基因片段，以此作为中间序列；

步骤4：用引物组扩增获得青虾KSPI基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组由如下引物组成：

正向外引物3 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

正向内引物3 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

反向外引物5 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

反向内引物5 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

步骤5：将所述KSPI基因cDNA序列的中间片段、所述KSPI基因的3’端和5’端片段拼接，即得。

作为优选，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。