[发明专利]水稻细胞转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物遗传学和基因工程领域。更具体地说，本发明涉及利用农杆菌介导和PMI选择标记来制备转基因水稻的方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa)是全世界一半以上的人口，尤其是亚洲国家人口的主粮。随着人口膨胀和耕地减少，水稻产量越来越难以满足需要。到2050年，世界人口将从现在67亿人增加到92亿人(联合国，2007)，这就要求到2050年粮食供应还需增加50％。随着半矮秆品种和杂交稻的推广，转基因手段被认为可望成为水稻增产的另一个突破点。2002年水稻全基因组测序完成后，可读框的功能注释和具有农学意义的基因的应用成为了水稻科研人员的主要研究目标。实现这一目的的前提条件是必须开发出高效率的水稻转化系统。这样的系统必须具有“多、快、好(可重复性高、基于成熟胚)、省”的特征，即能够以更低的成本在更短的时间内产生出更多的可育植株。

随着第一批转基因水稻问世以来(Zhang and Wu 1988；Toriyama et al.1988；Zhang et al.1988)，已经通过不同的转化方法，包括花粉管途径(Luo and Wu 1988)、微粒轰击(Christou et al.1991)、离子束(Yang et al.1994)等进行了大量的水稻转化研究。目前最常用的转化方法是农杆菌介导法。该方法由Hiei等人(Hiei et al.1994)建立。在此基础上，已经在粳稻(Chen et al.1998；Enriquez-Obregon et al.1999；Toki et al.2006)、籼稻(Lin and Zhang 2005；Hiei and Kumar 2006)和爪哇稻(Dong et al.1996；Diah and Anzai 2006)中建立了分别使用来源于成熟胚的愈伤组织或未成熟胚作为外植体的水稻转化系统。但这些转化系统中都需要用到抗生素或除草剂等有毒物质进行选择，对环境有潜在的影响。作为替代，已经有人开发了以磷酸甘露糖异构酶(pmi)基因作为选择标记，用无毒物质甘露糖作为正选择剂的转化系统(Joersbo and Okkels1996)。

PMI是首先由Miles和Guest从大肠杆菌中分离出来并测序(Miles and Guest，1984)。植物利用PMI能够将大部分植物无法代谢的6-磷酸甘露糖形式的甘露糖转化为大多数植物能够代谢的6-磷酸果糖。这样表达pmi基因的植物能够以甘露糖为唯一碳源生长。在农杆菌介导的植物细胞转化中使用pmi标记基因时，用甘露糖进行正选择。与杀死未转化细胞的负选择不同，在正选择中未转化的细胞保持休眠，而经过转化的表达pmi基因的细胞可以利用甘露糖作为碳源正常生长。这样，在培养过程中不会发生未转化细胞的坏死。由此，再加上碳元素是细胞骨架的重要成分，使得pmi基因在转化中的效率较高。此外，甘露糖在自然界中常见，能够被豆科植物如大豆(Lee and Metheson，1984)所代谢，因此对植物组织没有不良作用。考虑到这些原因，人们已经在不同科的植物中尝试了使用pmi作为选择标记，例如禾本科的玉米(Negrotto et al.2000)、珍珠稷(O’Kennedy et al.2004)、翦股颖(Fu et al.2005)、高粱(Gurel et al.，2009)、小麦(Wright et al.2001)、和甘蔗(Jain et al.2005)；十字花科的拟南芥(Todd and Tague，2001)和卷心菜(Ku et al.2006)、蔷薇科的苹果(Degenhardt et al.2006)、番木瓜(Zhu et al.2005)和杏(Ramesh et al.2006)；大戟科的木薯(Zhang et al.2000)、茄科的西红柿(Sigareva et al.2004)；藜科的甜菜(Joersbo et al.1998)；百合科的洋葱(Aswath et al.2006)；和葫芦科的黄瓜(He et al.2006)。由此可见pmi作为选择标记基因在粮食作物新品种的选育中有很大的发展潜力。2009年欧盟已经批准了使用PMI选择系统生产的转基因玉米的进口和加工作为食品和饲料的用途。在水稻转化研究中也已有人使用过pmi选择系统(Lucca et al.2001；He et al.2004；Ding et al.2006)，但其报道的转化效率都很低(仅6％左右)，不适于工业规模的生产。因此，本领域对于以PMI作为选择标记的高效、简便的水稻转化方法存在需求。

发明内容