[发明专利]一种鲟科鱼类卵子的筛选方法

权利要求书

1.一种鲟科鱼类卵子的筛选方法，其特征在于鲟科鱼类卵子的筛选方法，按以下步骤进行：一、从鲟科鱼类体内取出卵子；二、制备卵提取液：将步骤一取出的卵子剪碎，取鲜重5g，加入12～17mL浓度为0.02～0.05mol/L、pH为7.2～8.0的Tris-HCl缓冲液，在0～4℃研磨，得到的匀浆于12000～20000r/min的转速离心10～20min，取上清液，即为卵提取液；三、血清的制备：将20～30mL新鲜的鲟科鱼类尾椎静脉血或尾椎动脉血室温放置20～40min后，于0～4℃低温保存20～25h，然后于2000～4000r/min离心20～30min，抽取血清，保存备用；四、体液的制备：将步骤一取出的卵子经筛网过滤后，采集卵腔液15mL/尾，于液氮罐内保存：五、测定卵母细胞的极化指数；六、测定鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度；七、根据卵提取液测定鲟科鱼类卵Fe离子的含量、卵Zn离子的含量、卵V_E的含量和卵谷草转氨酶的含量；八、根据体液测定鲟科鱼类体液ACP的含量和AKP的含量；九、选取同时满足从鲟科鱼类体内取出卵子中85％的卵子的卵母细胞的极化指数≥0.07，鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度≥200μg/mL，卵Fe离子的含量≥170μmol/L，卵Zn离子的含量≥145μmol/L，卵V_E的含量≥0.12g/mL，卵谷草转氨酶的含量≥1400U/L，体液ACP的含量≥85U/g和AKP的含量≥39U/g的鲟科鱼类的卵，即完成鲟科鱼类卵子的筛选。

2.根据权利要求1所述的一种鲟科鱼类卵子的筛选方法，其特征在于步骤一中从鲟科鱼类体内取出卵子的方法为：将鲟科鱼类用丁香油水溶液麻醉，然后于尾部腹面3～5骨板处，使用取卵器沿腹壁肌肉直入体腔内部取出卵子；所述丁香油水溶液由丁香油和水按体积比1∶10⁴组成。

3.根据权利要求1或2所述的一种鲟科鱼类卵子的筛选方法，其特征在于步骤五中测定卵母细胞的极化指数的方法为：取步骤一得到的卵子30粒，放入沸水内，煮沸2～4分钟后，冷却至室温，然后沿卵极轴切开，测定胚泡到动物极卵膜的距离和胚泡到植物极卵膜的距离，按以下公式计算卵母细胞的极化指数，卵母细胞的极化指数＝胚泡到动物极卵膜的距离/胚泡到植物极卵膜的距离。

4.根据权利要求3所述的一种鲟科鱼类卵子的筛选方法，其特征在于步骤六中测定鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度的方法为：在96孔酶标板每孔中加入100μL的卵黄磷蛋白标准品，然后于4℃包被24h；弃去酶标板中的液体，每孔加入360μL封闭液，置于4℃封闭24h；洗涤：弃去封闭液，每孔加入300μL洗涤液，轻微震荡1min后，弃去洗涤液，重复洗涤3次；每孔加入100μL步骤三制备的血清和100μL酶标抗体，室温孵育1h后，弃去酶标抗体，用洗涤液洗涤4次；每孔加入100μL显色液，于室温暗处反应20分钟，加入50μL终止液，终止反应；用酶标仪测定OD值后，计算血清卵黄蛋白原浓度；其中终止液为0.5mol/L的H₂SO₄；洗涤液为含体积百分比浓度0.05％Tween20的稀释液，稀释液为PBS缓冲液，pH为7.4；封闭液为含体积百分比浓度1％牛血清白蛋白的稀释液；显色液为邻苯二胺溶液。

5.根据权利要求4所述的一种鲟科鱼类卵子的筛选方法，其特征在于步骤七中测定鲟科鱼类卵Fe离子的含量的方法为：取10mL试管3支，一支试管作测定管，测定管中依次加入0.2mL步骤二得到的卵提取液、2mL甘氨酸和盐酸羟胺的混合液、0.1mL 0.5mmol/L的显色剂非咯嗪；一支试管做空白管，空白管中依次加入2mL甘氨酸和盐酸羟胺的混合液、0.1mL 0.5mmol/L的显色剂非咯嗪；另一支试管作标准管，标准管中依次加入0.2mL35.7μmol/L的标准液硫酸亚铁，2mL甘氨酸和盐酸羟胺的混合液，0.1mL 0.5mmol/L的显色剂非咯嗪，将三支试管混合均匀后，置于37℃水浴中10min，然后用分光光度计比色，波长578nm，试剂空白调零点，读取吸光度值，计算Fe离子的浓度；其中甘氨酸和盐酸羟胺的混合液中甘氨酸的浓度为100mmol/L，盐酸羟胺的浓度为2mmol/L。