[发明专利]一种特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子的筛选及应用

说明书

技术领域

本发明涉及利用SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)筛选获得一种与鼠伤寒沙门氏菌高亲和力、高特异性识别的寡核苷酸适配子，以及该寡核苷酸适配子在鉴别沙门氏菌中的应用，属生物技术领域。

背景技术

鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)，属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一。在我国内陆地区，由沙门氏菌引起的食物中毒屡居首位。据资料统计，在我国细菌性食物中毒中，70％--80％是由沙门氏菌引起，世界各地的食物中毒中，英国、中国沙门氏菌食物中毒居首位。目前，在全球范围内，特别是发展中国家感染沙门氏菌的人数逐年增多，食源性致病菌的耐药性对食品安全及人类健康的影响已经引起很多国家的警惕。因此建立准确、灵敏、快速的沙门氏菌检测技术对于食品安全具有重要意义。

传统的微生物检验，往往既耗时又不灵敏；新发展起来的PCR技术，虽然能缩短检验时间，但灵敏度仍然不高；免疫学方法具有特异性强、灵敏度高、易于观察等优点，但制备抗体的时间比较长，成本高，且不稳定。近些年来，由于寡核苷酸适配子(aptamer)较之抗体有诸多优点：成本低，稳定性好，易于修饰等等，因此被作为抗体分子的前景性替代分子，受到很多领域的关注。SELEX是一种随机生物文库技术，它利用大容量的随机寡核苷酸库(由两端的固定序列和中间20～40个碱基的随机序列组成)与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技术，使其得到指数级富集，如此循环数轮，最终进化成为高亲和力、高特异性的寡核苷酸配体。适配子与靶物质结合的特异性和亲和力可与抗体媲美，甚至优于抗体，加上其技术上和稳定性方面的优势，近10多年来，采用SELEX技术筛选核酸适配子不断被应用于生命科学各个领域的研究工作中，包括对疾病的诊断与治疗。

本发明以常见的鼠伤寒沙门氏菌为目的靶细菌，利用SELEX技术获得了一条能与鼠伤寒沙门氏菌高亲和力，高特异性结合的寡核苷酸适配子，能够快速、灵敏、特异的检测到鼠伤寒沙门氏菌。

发明内容

本发明目的在于提出特异识别鼠伤寒沙门氏菌的一条寡核苷酸适配子的序列以及应用。

本发明优点：

1)与蛋白类抗体相比，aptamer合成周期短，成本低；aptamer更稳定；aptamer可直接体外合成、易于标记，使得操作更为简单迅速。

2)该序列是从9条均能识别鼠伤寒沙门氏菌的aptamer中，选出的亲和力最强，特异性最好的一条aptamer，能高亲和力高特异性识别鼠伤寒沙门氏菌。

附图说明

图1S1-S9二级结构

图2S1-S9解离常数

图3S2的特异性分析图

具体实施方式：

下面是通过SELEX技术筛选特异性结合鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子的方法以及快速检出鼠伤寒沙门氏菌的应用。

1、合成随机单链DNA文库和引物(IDT公司合成)

随机ssDNA文库：

5’-ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-N40-TATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3’

构建了长度为87nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40个碱基的随机序列，库容量在10¹⁴以上；引物I：5’-ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-3’；引物II：5’-ATTAGTCAAGAGGTAGACGCACATA-3’，将随机ssDNA文库和引物用TE缓冲液配制成100μmol/L贮存液-20℃保存备用。

2、BBL液体培养基培养鼠伤寒沙门氏菌，37℃摇床培养至对数生长期(OD₆₀₀＝0.3)，收集菌液1800g 4℃离心5min，弃上清，用1×结合缓冲液(1×BB)(50mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mM KCl，100mM NaCl，1mM MgCl₂)清洗，去除多余的培养基成分。

3、SELEX筛选获得鼠伤寒沙门氏菌特异的寡核苷酸适配子