[发明专利]一种控制水稻株高和穗颈长的基因及应用

权利要求书

1.一种减弱人工microRNA干涉eui-1基因功能的target mimic基因MIMa在调控水稻株高和穗颈长性状中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO：3所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征包括如下步骤：

(1)将干涉水稻eui-1基因的microRNA基因构建到pC1300-Ubi-nos载体上，得到重组质粒pEUI-amiRNA，用该重组质粒转化水稻ZS97B，得到转基因材料eZS97B；

(2)将转基因材料eZS97B与水稻材料ZS97A杂交得到长穗颈的水稻材料eZS97A，其保藏号为CCTCC NO P201111；

(3)设计扩增MIMa基因的引物MIMIII、MIMIV、EuiMIMIa和EuiMIMIIa，然后用两轮PCR合成MIMa基因，并将MIMa基因构建到pC1300-Ubi-nos载体上，得到重组质粒pC1300-MIMa，用该重组质粒转化水稻材料MH63，得到转基因水稻材料MH63-MIMa，其保藏号为CCTCC NO P201112；

(4)用长穗颈的水稻材料eZS97A与MH63-MIMa进行杂交，得到株高和穗颈长恢复到野生水平的水稻材料；

其中：步骤(1)所述的microRNA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；

步骤(1)所述的重组质粒pC1300-Ubi-nos含有序列表SEQ ID NO：1所示的microRNA基因；

步骤(3)所述的MIMIII、MIMIV、EuiMIMIa和EuiMIMIIa引物序列的核苷酸序列如下所示：

MIM-III CCCTGCCTTCATACGCTATT(5′-3′)；

MIM-IV ATTGCCAAATGTTTGAACGA(5′-3′)；

EuiMIM-Ia atATGAGAACTAAACCGCACGGGTGCccttagtagaggtaaaagtc(5′-3′)；

EuiMIM-IIa ggGCACCCGTGCGGTTTAGTTCTCATattattcggtggatgtctgt(5′-3′)；

其中步骤(3)所述的重组质粒pC1300-Ubi-nos含有序列表SEQ ID NO：5所示的MIMa基因；

其中步骤(3)所述的PCR方法如下所述：

使用引物组合EuiMIMIa+MIMIII和EuiMIMIIa+MIMIV进行第一轮PCR反应，反应体系为：5×phusion HF reaction Buffer 10μl，2μM dNTPs 5μl，50nh/μl MT375质粒2μl，10μM左、右引物各2μl，phusion DNA polymerase 0.5μl，补灭菌超双蒸水至50μl；

反应条件为：98℃ 30s；98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 15s重复循环35次；72℃ 5min。将PCR产物于0.8％琼脂糖胶电泳，挖胶后回收PCR产物，最后溶于30μl elution buffer；用回收的第一轮PCR的两种PCR产物进行第二轮PCR；反应体系为：10x ExTaqE Buffer 5μl，2μM dNTPs 5μl，两种第一轮PCR产物各2μl，10μM的引物MIMIII和MIMIV各2μl，Ex Taq 0.5μl，补灭菌双蒸水至50μl；

反应条件为：94℃ 2min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min重复循环35次；72℃ 5min；最终PCR产物克隆于T载体pGEM-T上，然后测序验证；利用BamH I和Kpn I酶切含有MIMa的T体释放出MIMa基因，并将MIMa克隆于中间载体pC1300-Ubi-Nos上获得最终表达载体pC1300-MIMa。