[发明专利]一种兼具SOD和GPx活性的65肽

说明书

技术领域

本发明属于人工模拟酶领域，具体涉及一种通过基因重组技术制备的具有超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)双活性的含硒金属65肽化合物。 

背景资料 

机体内抗氧化系统的平衡直接影响着人类重大疾病的发生与发展，抗氧化酶间的相互协同作用能够维持这个系统间的平衡。其中SOD和GPx是生物体天然抗氧化酶系的重要成员，大量的研究已经从分子、细胞、组织及活体的水平上证明，SOD和GPx相互协同作用清除和人类多种疾病的发生和发展密切相关的高浓度的ROS(reactive oxygen species，ROS)，并且这种协同对机体的正常代谢至关重要。因此，开展具有SOD和GPx协同抗氧化效应的模拟化合物的研究至关重要。而且，较大分子量的模拟物普遍透膜性差，在机体内不易吸收，势必会限制其结构功能的探索及药用前景。而短肽作为模拟酶，由于其一级结构较短，且只有单一的催化位点，不能形成和天然酶活性部分类似的精巧三级结构，势必造成不稳定、非特异的底物结合能力和低的催化效率。因此，开发小分子量肽酶模拟物，尤其是利用基因工程法制备肽酶，更有利于肽酶的获得及改造，具有极大的基础研究及应用前景。 

基于以上原因，我们另辟蹊径，以刚刚获得晶体结构的SOD3为模板，保留了其活性必须的氨基酸序列，引入了SOD活性中心的Cu²⁺和稳定活性基团的Zn²⁺，同时插入了一段具有GPx底物GSH特异性结合位点的15肽，又通过结构模拟，在特定部位引入了除GPx活性残基Sec以外的对稳定活性部位起到至关重要的氨基酸残基Gln和Trp组成催化三联体，并利用Cys营养缺陷型表达系统，获得一种具有精巧的双酶活性中心结构域的铜锌含硒65肽即Se-CuZn-65P。Se-CuZn-65是一种具有双酶活性，位点清晰，结构稳定，催化机理明确的具有抗氧化协同效应的小分子65肽，这不仅对阐明酶的催化机理以及相互间协同作用有重要意义，而且还有广阔的药用前景。 

本发明的特色在于和以往的引入一个或几个催化基团不同，是引入系列催化氨基酸群，建立具有SOD和GPx催化活性中心的结构域，构建新型双功能模拟酶。把SOD活性中心结构域和GPx活性中心结构域有机的整合在一起，使它们能够在各自发挥活性的基础上又能相互协同作用。 

本发明的具体制备步骤： 

I.Se-CuZn-65P氨基酸和核酸序列的设计 

依据天然SOD1，SOD3和bovine erythrocyte SOD的活性部位的同源序列比对，以晶体结构更清晰的SOD3为模板，保留了其同源性最高的氨基酸序列，删除了同源性低且对活性中心没有贡献的氨基酸残基，引入了SOD活性中心的Cu²⁺，同时也引入了稳定活性基团的Zn²⁺，并在正确位置安放了一些关键氨基酸残基，如His1，His3，His18，His26，His29，His61 Asp32，Asp65，这些氨基酸残基能够和Cu²⁺，Zn²⁺形成正确的和天然SOD相似的三维结构。同时插入了一段具有GPx底物GSH特异性结合位点的15肽，并通过结构模拟，在催化残基Sec58的附近引入了Gln2和Trp33，使形成和天然GPx相似的催化三联体结构，而且在其周围围绕了Leu8、Phe36、Phe5、Leu43、Leu47、Trp44、Phe46和Tyr52等一些输水氨基酸稳定催化三联体结构，构建了一段具有SOD和GPx双活性部位的含金属离子的65P。由于Sec的三联体密码子是作为终止子的UGA，而它的正常掺入需要复杂的调控机制，因此利用传统的基因工程方法很难表达硒蛋白，而利用Cys缺陷E.coli自身不能合成Cys的特点，使其在缺少Cys而富含Sec的培养基中表达，可使Sec(U)代替Cys(C)被细菌利用于合成新生蛋白质。因此，表达前的Sec58的初始氨基酸是Cys58，需要通过Cys营养缺陷型表达将Sec掺入。其初始氨基酸序列如Table 1： 

Table 1 The amino acid sequences of peptides. 

II.Se-CuZn-65P基因表达载体的构建 

根据引物设计原则，在引物设计软件Primer5.0的辅助下，设计2对引物，引物序列见Table 2。两端分别设计BamH I和EcoR I酶切位点，用来克隆到可溶性表达载体pPelB中。