[发明专利]一种茶氨酸定量测定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域，特别涉及对植物样品纸层析后用分光光度计测定茶氨酸含量的方法。

 

背景技术

L-茶氨酸又名谷氨酰乙胺，英文名L-Theanine，Cas号：3081-61-6，分子式：C₇H₁₄N₂O₃，属酰胺类化合物，为白色或类白色粉状，熔点214-215度，极易溶于水，具有焦糖香和类似味精的鲜爽味。

L-茶氨酸在自然界仅存在于山茶属部分植物和一种蕈中，占茶叶干重的1%~2%之间，约占整个游离氨基酸的50％以上，是构成茶风味的主要物质之一，也被广泛应用于食品行业。现代医学证实茶氨酸对人体具有多方面的保健作用，尤其能够调节神经递质，平和人的情绪，用于治疗焦虑、失眠、儿童多动症等。

目前测定茶氨酸的方法主要有高效液相色谱（HPLC）法、毛细管电泳法、氨基酸自动分析仪法、阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法。这些方法具有灵敏度高和准确性强的特点，但设备购置和维护成本很高，无法满足普通实验室对茶氨酸测定的需求。

分光光度计价格低廉、容易操作，是实验室的常备仪器。茚三酮反应是实验室测定氨基酸最常用的方法，其原理是氨基酸与茚三酮反应生成的产物在570nm处具有最高的吸光度，在一定范围内符合比尔定律。但用这种方法测出来的是茶中各种氨基酸的混合结果。高小红等人2005年在《光谱实验室》杂志第3期报道“分光光度法测定茶叶中的茶氨酸”，用浓盐酸将茶氨酸分解成乙胺，利用胺的氯代衍生物能氧化碘化钾而析出碘，加人淀粉后，溶液的颜色即可达到最深，10min内吸光度稳定的性质进行茶氨酸定量测定。然而该方法涉及NaOH、NaHCO₃、NaClO₃、NaNO₂、淀粉、KI等诸多药品，操作步骤繁杂，尤其是中间加入NaClO₃后需要放置1min，加入NaNO₂后放置5min，当测定有数个样品时，这些时间很难控制，更有显色时间仅仅10分钟，不适合多个样品同时测定。

阮宇成和王月根1981年在《茶叶通讯》第3期发表文章“茶氨酸的简化定量法”，依次用乙醚-—醋酸乙酯混合液和乙醇溶液浸提茶样，浓缩浸提液，溶于乙醇溶液，离心后取上清液20—25μL在圆形滤纸上点样，浓氨水熏，吹去氨气，用正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶1作展层剂，水平展谱。干燥，用新的展层剂再次展谱。纸谱干燥后用茚三酮溶液喷雾，干燥、显色，乙醇溶液洗脱，分光光度计570nm处比色测定。测定所用标准溶液由茶氨酸纯品配制，剪下纸谱茶氨酸斑点旁的一处作空白。该方法使用的乙醚极易挥发，为麻醉剂，属危险品，醋酸乙酯、正丁醇、冰醋酸、氨水皆为对人体有刺激性的低毒类药品；圆形滤纸因直径有限展谱距离较短，需要连续二次展谱才能将氨基酸分离，造成浪费药品且没有时间优势；显色反应发生在纸层析之后茚三酮喷雾，由于显色剂没有量的控制，导致色斑不均匀：标准曲线通过配制而成，标样没有进行纸层析步骤，与测定样品处理不同，产生测定误差：空白没有专门点样，随意剪下，这些造成测定不够精准。

 

发明内容

本发明的目的旨在提供一种简单、安全、可靠的茶氨酸分光光度计检测方法，以满足普通实验室进行茶氨酸生物化学实验与研究的需要。

为实现所述目的，本发明采用技术方案如下：

本发明的茶氨酸定量测定方法，包括下述步骤：

（1）浸提：以60-100ml沸水浸提0.2-4.0g干茶样30-60min，冷至室温，过滤，定容至100ml，得茶浸提液；

（2）点样：将茶氨酸标准溶液、空白对照蒸馏水和茶浸提液分别在滤纸上点样；所述标准溶液浓度在0.06-0.2mg/ml且选取同一浓度的标准溶液按照不同点样量至少点出三个点；

（3）展层：以乙醇-水-茚三酮混合溶液作为展层剂，垂直层析；所述乙醇-水-茚三酮混合溶液中，乙醇体积分数70-80%，茚三酮体积分数0.1-0.3%；

（4）洗脱：将层析后的滤纸于40-80℃烘干，裁下标准溶液茶氨酸色斑滤纸、茶浸提液中茶氨酸显色带的滤纸以及空白对照区域滤纸，乙醇溶液洗脱，得标样洗脱液、茶样洗脱液和空白对照洗脱液；

（5）比色、计算：以空白对照样品为参比，使用分光光度计570nm处分别测定标样溶液和茶样溶液的吸光值；制作标准曲线，求出回归方程，计算茶样品中的茶氨酸含量。计算公式：