[发明专利]松材线虫的冷冻保存及解冻方法有效
| 申请号： | 201110282637.0 | 申请日： | 2011-09-22 |
| 公开（公告）号： | CN102428909A | 公开（公告）日： | 2012-05-02 |
| 发明（设计）人： | 汪来发;朴春根;王曦茁;朱天辉;李永;李沁;郭民伟;林彩丽;田国忠 | 申请（专利权）人： | 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 |
| 主分类号： | A01N1/02 | 分类号： | A01N1/02 |
| 代理公司： | 北京市德权律师事务所 11302 | 代理人： | 余光军 |
| 地址： | 100091 北京市海*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 松材线虫 冷冻 保存 解冻 方法 | ||
1.一种松材线虫(Bursaphelenchus xyfolus)的程序化冷冻保存及解冻方法，包括以下步骤：（1）预处理松材线虫悬液；（2）预处理后的松材线虫悬液中加入冷冻保护剂，平衡处理；（3）平衡处理后的松材线虫悬液程序化降温后冷冻保存；（4）解冻复苏；其特征在于，所述的程序化降温的程序如下：以1℃/min的降温速率将平衡处理后的松材线虫悬液从4℃降温至-6℃；再以20℃/min的降温速率降温至-40℃；以10℃/min的升温速率升温至-20℃；最后以1-0.5℃/min的降温速率将松材线虫悬液从-20℃降温至-45℃后迅速投入液氮中进行冷冻保存。
2. 按照权利要求1所述的程序化冷冻保存及解冻方法，其特征在于：所述的程序化降温的程序如下：以1℃/min的降温速率将平衡处理后的松材线虫悬液从4℃降温至-6℃；再以20℃/min的降温速率降温至-40℃；以10℃/min的升温速率升温至-20℃；最后以1℃/min的降温速率将松材线虫悬液从-20℃降温至-45℃后迅速投入液氮中进行冷冻保存。
3. 按照权利要求1所述的程序化冷冻保存及解冻方法，其特征在于：按v/v计，步骤（1）中所述的预处理是向松材线虫悬液中加入甘油至甘油的终浓度为5-10%，放置1-3天。
4. 按照权利要求3所述的程序化冷冻保存及解冻方法，其特征在于，步骤（1）中所述的预处理是向松材线虫悬液中加入甘油至甘油的终浓度为5%，放置1天。
5. 按照权利要求1所述的程序化冷冻保存及解冻方法，其特征在于，步骤（2）中所述冷冻保护剂在松材线虫悬液中的组成成分及终浓度为：按v/v计，10%-15%甘油＋0.25M蔗糖。
6. 按照权利要求1所述的程序化冷冻保存及解冻方法，其特征在于：步骤（2）中所述的平衡时间为1-3h。
7. 按照权利要求6所述的程序化冷冻保存及解冻方法，其特征在于：步骤（2）中所述的平衡时间为2-3h。
8. 按照权利要求1所述的程序化冷冻保存及解冻方法，其特征在于：步骤（4）中所述的解冻复苏是在40℃-50℃的温度进行水浴解冻。
9. 按照权利要求8所述的程序化冷冻保存及解冻方法，其特征在于：步骤（4）中所述的解冻复苏是在40℃的温度进行水浴解冻。
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