[发明专利]哺乳动物细胞大规模生产重组人IGF1-Fc融合蛋白的实验技术

说明书

技术领域

本发明涉及一种将人胰岛素样生长因子-1与人免疫球蛋白IgG1的Fc段融合基因(IGF1-Fc)转入哺乳动物细胞以大规模生产其蛋白产物的技术。 

背景技术

1.IGF-1蛋白的生物学作用与应用前景 

胰岛素样生长因子-1(IGF1)，又称为促生长因子(即somatomedin C)，是一种由生长激素诱导、通过旁分泌或自分泌方式产生的小分子细胞因子(约70氨基酸)，因其结构与胰岛素类似而得名，是生长激素发挥生理作用必须的一种活性蛋白，在生长发育及成人的合成代谢过程中发挥重要功能。 

IGF1对机体的生长发育至关重要。IGF1是生长激素首要的效应因子，在细胞生长、分化及损伤修复过程中发挥重要功能。IGF1是体内非常重要的细胞有丝分裂促进剂，IGF1与其受体IGF1R结合能够激活AKT信号通路，从而诱导细胞的分裂增殖，并抑制细胞程序性死亡；IGF1对于细胞分化相关蛋白的表达十分重要，其与某些生长因子协同作用可促进效应细胞的分化和成熟；IGF-1还参与创伤愈合的过程。实验证明，损伤的神经、肌肉和内皮细胞中IGF-1浓度增加。IGF1表达缺陷能引起个体发育不良甚至侏儒，例如Laron综合症。外源的重组IGF1能够矫正这种缺陷。IGF1自身可以作为药物用于与发育缺陷相关疾病的治疗。 

IGF1对于机体的代谢功能也扮演着重要角色。IGF1能促进糖原的合成和乳酸分泌并抑制糖原分解，增加集体对葡萄糖和氨基酸的吸收，，达到降低血糖的目的；IGF-1还能作用于脂肪细胞，促进脂肪分解和糖原合成，从而降低血脂水平。有研究表明，将IGF1用于胰岛素非依赖型的糖尿病患者能明显降低其血液中葡萄糖的浓度，疗效显著。另外，IGF1在骨的合成代谢中也发挥着重要的作用。IGF1可促进软骨细胞分裂增殖及软骨基质的形成，并刺激合成软骨基质特异型胶原蛋白-II型胶原；IGF1还能增强成骨细胞中某些代谢酶类的活性，对于骨的正常结构和功能是必需的。IGF1将用于骨质疏松症中防治能收到明显的效果。目前，国际上很多公司已经开展IGF1蛋白作为治疗药物的技术和产品开发，例如，Genentech，Cephalon，Chiron等。Tercica和Insmed公司的IGF1相关产品(Increlex和iPlex)已经通过美国FDA的审批上市。 

IGF1的过度表达与肿瘤的发生和发展有密切关系，临床研究证实人体多种肿瘤组织或血液中IGF1和或其受体的表达明显高于正常组织。在体内许多肿瘤，如肺癌、结肠癌、乳癌、前列腺 癌、膀胱癌等肿瘤组织中高表达，其在外周循环中表达水平也升高。流行病学研究表明，循环中IGF-1水平升高与很多恶性肿瘤的发病率呈正相关，提示IGF1可能参与了某些肿瘤的发生发展过程。IGF1可望作为相关肿瘤的重要检测指标用于早期的诊断或预后的评价；另外，IGF1还可作为肿瘤治疗上的新靶点，阻断其产生、其与受体相互作用，或其信号通路的效应因子如癌基因的表达，对于阻断肿瘤细胞向周围组织的扩散转移或肿瘤的复发可能有重要意义。 

除此之外，IGF1还与其它一些疾病，如心脏病、脊髓侧索硬化症、衰老等关系密切。IGF1作为靶分子的研究将为许多疾病的早期诊断和治疗提供了新的方向，在药物研究及临床检验中具有广阔的市场前景。 

2.Fc融合蛋白的表达 

免疫球蛋白IgG的Fc融合蛋白是指在基因水平将目的基因同IgG的Fc片段基因相连而表达的重组蛋白，同时具有目的蛋白及免疫球蛋白的结构域，从而赋予了重组蛋白许多新的特性，拓展了蛋白在科研、制药及临床等方面的应用。 

在重组蛋白表达的过程中，Fc重组蛋白易于结合Protein A，从而简化了蛋白的纯化过程；Fc片段可以方便地进行流式、免疫组化和免疫共沉淀等方法检测，可用于感兴趣的基因研究；体外实验中，Fc融合蛋白可用于拮抗或激活细胞表面受体用来研究受体-配体反应和信号通路；此外，Fc重组蛋白还能应用于噬菌体展示技术，如作为抗原制备人类全抗体库。 

另外，Fc片段还赋予了重组蛋白一些其它特性，增加了其在在制药和临床方面的应用价值。融合蛋白中加入重链的恒定区，其半衰期明显延长，延长了其在体内的半衰期；Fc段能穿过胎盘、结合补体并介导补体依赖的细胞毒作用等；重组蛋白含有的铰链区结构域使其形成二聚体或多聚体，增强了其抗原结合力。以上这些特点拓展了融合蛋白在感染性疾病、自身免疫性疾病及移植排斥反应的治疗方面的临床应用前景。 

3.研究现状