[发明专利]一种机械法分离培养猪精原干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞分离培养领域，具体涉及一种机械法分离培养猪精原干细胞的方法。

背景技术

精原干细胞（Spermatogonial stem cells, SSCs）是位于雄性动物睾丸曲细精管基膜上既能自我更新维持自身群体数量恒定，又能定向分化，最终产生精子的一类未分化的A型精原细胞，也是成体内唯一可复制的多潜能双倍体细胞。

体外分离SSCs的方法主要集中在机械法和酶消化法相结合的方法，现在主要通过酶消化的方式获得SSCs，再通过各种纯化手段最终得到单一的SSCs，是否纯化后更有利于SSCs增殖，也说法不一。而目前PSSCs（Porcine spermatogonial stem cells, PSSCs）增殖培养的方案还不成熟，其调节机制尚未清楚解析。PSSCs培养仍然存在着较大困难，更多的问题还有待更深入研究。

胰蛋白酶作为常规的细胞消化试剂，是酶消化法中的主要用酶，广泛应用于多种类型的组织和细胞消化，但是胰蛋白酶消化后，细胞表面的粘附分子或膜蛋白极易受到破坏，对于这类具有立体结构用以维持细胞增殖及自我更新的细胞来说，很难迅速恢复细胞状态。往往伴随着大范围的细胞死亡/凋亡。早期通过使用胰蛋白酶消化成功获得了小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ES细胞），但分离效率却很低。神经干细胞（Neural stem cell , NSC）以及人胚胎干（hES）细胞在胰蛋白酶消化后，极容易死亡，很难获得传代培养，因而多用机械分割法进行传代。组织块培养法是一种常用细胞分离方法，最常见于一些成纤维组织细胞分离培养，其实验操作简单，成功率高，避免了酶消化对细胞影响。

目前研究的纯化方法主要有：流式细胞分选法（Fluorescence activated cell sorting，FACS）、免疫磁珠细胞分选法（Magnetic-activated cell sorting，MACS）、自然重力沉降法、差速贴壁分选法和密度梯度分选法等。但各种方法都存在着不足。在现有研究背景下，我们使用的机械法分离PSSCs，避免了使用酶消化的方式，减少了酶对细胞损伤作用，更符合机体内环境条件，在已筛选的培养体系里较快和较早得到PSSCs的克隆。故机械法分离培养PSSCs的方法是一种简单有效的分离方法。

发明内容

本发明的目的在于根据现有的细胞分离培养方法中存在的不足，提供一种分离容易、培养要求低、操作简单、降低实验成本的机械法分离培养PSSCs的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种机械法分离培养猪精原干细胞的方法，包括如下步骤：

（1）将仔猪的睾丸放入盛有PBS的容器中，用PBS洗涤2~3次，除去血污；

（2）去掉睾丸白膜和结缔组织，将剩下的睾丸组织剪碎，转移到离心管中；

（3）加入10倍体积的PBS，用吸管吸打，16 ℃、600 rpm离心5 min，弃上清；

（4）重复步骤（3）2~3次，得到猪睾丸曲细精管；

（5）将猪睾丸曲细精管接种到事先用0.1 %明胶包被的培养瓶，放入培养箱中进行无菌培养。

作为一种优选方案，上述方法中，所述细胞培养箱的培养条件为37 ℃，5% CO₂，饱和湿度。

作为一种优选方案，上述方法中，所述细胞培养时所用的细胞培养液主要成分为：DMEM 83 %，L-谷氨酰胺1 %，非必需氨基酸1 %，β-巯基乙醇55 μM，胎牛血清15 %。

通过本实验方法获得大量PSSCs克隆团后，通过机械法挑取切割克隆团，后接种到新的饲养层上，进行传代培养，可进行诱导分化，诱导IPS细胞和转基因动物等方面的研究。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：