[发明专利]一种不含活菌的苏云金芽孢杆菌基因工程杀虫剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于苏云金芽孢杆菌基因工程菌安全应用领域，涉及苏云金芽孢杆菌工程菌及其制剂的处理方法，及由该方法所获得的产品。 

背景介绍

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌。大部分菌株在芽孢化期间产生一种或多种伴孢晶体，这些晶体由杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，简称ICPs)组成，杀虫晶体蛋白为杀虫的主要成分。伴孢晶体被目标害虫吞食后，ICPs在消化道中被降解为具有杀虫活性的小分子多肽，再与中肠上皮细胞BBMV(Brush border membrane vesicles)上的受体结合，造成细胞膜形成孔道、上皮细胞渗透压破坏及细胞溶解，最终导致细胞死亡(龙綮新、庞义，1994)，不同来源的Bt菌株的ICPs其杀虫谱不同，但作用机理基本相同。苏云金杆菌制剂目前世界上应用最广泛，使用面积最大的一类微生物杀虫剂，其应用量占整个生物杀虫剂的90％。但是由于Bt存在杀虫谱比较窄，只能对一种或几种害虫有效，且目前发现一些害虫对Bt产生了抗药性，限制了Bt的应用于推广。为了解决Bt使用过程中出现的一些问题，提高ICPs的杀虫毒力同时避免害虫抗药性的产生等问题，构建高效Bt工程菌已经成为Bt的研究热点，2001年庞义研究小组利用Tn917转座子通过转座作用成功地将来源于以色列亚种Bti的两个杀蚊蛋白基因整合到库斯塔克亚种Btk染色体中，成功构建了既杀鳞翅目昆虫又杀双翅目昆虫的高效稳定的Bt工程菌株TnY和高效专性杀蚊幼虫的工程菌株TnX(Yu et al.，2001)，并获得中国发明授权专利。其中TnX比现有商品化的以色列亚种4Q2的杀虫毒力高1.82倍，因此极具商品化潜力。 

虽然通过基因工程的方法构建的Bt工程菌，在杀虫毒力、晶体蛋白产量、扩大杀虫谱等方面都有不同程度的提高，但工程菌释放到环境之前必须确保工程菌株对环境是安全的。通常那些通过基因工程手段构建的高毒力Bt工程菌株，构建过程中常含有抗性筛选标记如红霉素抗性基因Em等，使得这些工程菌制剂在生产、注册和应用上受到限制。抗生素抗性致病细菌的出现引发生物安全问题受到人们的关注，具有抗性的微生物一旦进入环境就很难回收及控制，且可能会与亲缘性相近的微生物之间进行基因间水平转移(horizontal gene transfer，HGT)，基因水平转移是微生物之间拥有抗生素抗性基因的主要机理，并且已 经证明抗生素抗性基因已经发生在非病原菌、病原菌之间，甚至相关的微生物之间，诸如革兰氏阳性菌和阴性菌之间都有可能发生，因此一些致病的微生物具有抗生素抗性基因，进一步增加了风险评估的复杂性。 

苏云金芽孢杆菌和与人类相关的致病菌炭疽杆菌(Bacillus anthracis)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)同属亲缘较近的芽孢杆菌类(Rasko et al.2005)，Bt的最大区别在于芽孢分化期能够产生伴孢晶体，而伴孢晶体早已证明是安全的，所以Bt可以作为生物农药用于田间。为了能够保证将Bt工程菌释放到环境中是安全的，国内外学者已经尝试各种各样的方法。 

1990年，美国Mycogen公司发明了一种生物囊技术，将携带ICP基因的质粒导入荧光假单胞杆菌，发酵后通过物理和化学的方法致死菌体，形成带有杀虫晶体蛋白的死菌体包囊系统。另外，2005年，Gunjan Pandey提出采用自杀式基因工程菌，但很难找到合适的基因，且有可能造成Bt工程菌的毒力下降。众所周知，苏云金芽孢杆菌中的主要杀虫成分为ICPs，而芽孢是为了抵御不良的环境条件所必须的，只要芽孢失活，Bt就不能存活。为此，通过杀死基因工程菌中的芽孢就可以保证释放到环境中的Bt是安全的。 

1993年崔云龙、邵宗泽用优氯净(二氯异氰尿酸钠)、紫外线处理苏云金芽孢杆菌试图灭活芽孢，但同时也使得晶体蛋白难溶于昆虫胃液或碱液，毒力显著下降。1996年，申继忠提出双氧水能够使伴孢晶体蛋白的一级结构受到破坏，但同时毒力片段数量减少。2002年，Becker提出采用Co⁶⁰γ-射线处理苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis israelensis)，在20KGY的辐射剂量时，可以全部杀死芽孢，但对伊蚊幼虫杀虫毒力下降20～30％(Becker，2002)，而我们采用动态Co⁶⁰γ-射线辐照的方法来分别处理工程菌株TnY(Yu，Pang et al.，2001)，杀虫毒力并不下降，通过统计学分析，辐射处理前后杀虫毒力无显著性差异。 

发明内容