[发明专利]一种EPS基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD

说明书

技术领域

本发明涉及一种EPS基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD和包括该基因簇的嗜热链球菌。 

背景技术

嗜热链球菌是发酵乳生产中必不可少的乳酸菌菌株，其常常与保加利亚乳杆菌配比使用，某些嗜热链球菌在发酵乳制品生产中不仅起到前期的产酸作用，而且还有发挥一个非常重要的生物功能，就是产生胞外多糖，嗜热链球菌产生的胞外多糖具有增加黏度、改善发酵乳质构、流变特性及口感等作用，近年人们通过大量动物实验证明嗜热链球菌产生的胞外多糖除了上述作用外还拥有一定的益生功能，如：降胆固醇、增强粘膜吸附、增加机体免疫力和抗肿瘤等作用。 

    嗜热链球菌产生的胞外多糖均为杂多糖，是由不同的单糖组合而成的，组成杂多糖的单糖包括葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、果糖等。杂多糖是通过聚合在细胞质中形成的前体物质即重复单元的聚合反应而形成的，其生物合成和分泌过程需要一系列的酶和蛋白质，该过程可以分为四个反应阶段：糖转运进入细胞质，合成糖-1-磷酸，糖的激活和耦合及多糖转运出细胞质。决定嗜热链球菌产胞外多糖的基因簇均存在于菌株的染色体上，相关研究表明嗜热链球菌有一个复杂的基因组织负责EPS的生物合成和分泌。例如，通过Tn916诱变和对比染色的平板分析方法鉴定出S. thermophilus Sfi6位于染色体上的eps基因簇，是一段长14.52kb的DNA，编码Eps A到EpsM十三个基因。EpsE, EpsF, EpsG和EpsI基因在大肠杆菌中表达和体外用薄层色谱分析¹⁴C标记核苷酸的糖基转移酶反应，鉴定出EpsE、EpsG和EpsI分别是β-半乳糖酶、α-1,3-N-乙酸半乳糖胺和β-1,3-葡萄糖转移酶。通过排除，α-1,6-半乳糖转移酶应该是EpsF，它是糖基转移酶基因留下的没有功能的片段。Eps K基因与多糖输出有关，EpsI基因与聚合作用有关，EpsA、EpsB基因与决定链长有关。总之不同菌株的EPS基因簇的基因组的构成、转录的方向和功能表现出高度的保守性。根据同源性调查这类基因簇由四个功能区域组成，一个中心区域带有表现糖基转移酶同源性，这些酶是EPS重复单元生物合成的专一酶，两个在中心区域侧翼的区域，表现参与聚合作用和运输的酶的同源性(链长的控制、转运、聚合)和一个位于基因簇开始端的调节区域。 

了解和阐明EPS基因簇的功能有助于我们掌握嗜热链球菌生产胞外多糖的基因调控机制，弄清EPS基因簇与嗜热链球菌生产胞外多糖的关系，可为产粘乳酸菌筛选、益生菌株(拥有EPS相关益生功能)筛选以及用于菌株的基因改造提供基础性的研究材料。 

发明内容

  本发明人针对上述问题，以传统发酵乳制品中乳酸菌为目标菌群，采用特定的筛选方法，从甘肃省甘南县采集的传统发酵乳制品中筛选出产粘菌株，得到一种产胞外多糖嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus ，MN-ZLW-002)及其筛选方法，并进一步研究了该产粘菌株中EPS基因簇以及其与胞外多糖产生之间的关系。 

    本发明的目的之一是对产胞外多糖嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus )MN-ZLW-002中相关EPS基因进行克隆和测序。 

    本发明的目的之二是通过PCR确定EPS基因簇与胞外多糖产生之间的关系。 

    本发明的目的之三是提供胞外多糖(EPS)基因簇或EPS基因在筛选和改造乳酸菌中的应用。 

    本发明的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) MN-ZLW-002已于2010年5月7日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所)，保藏号：CGMCC No.3817。 

    本发明提供了从所述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) MN-ZLW-002中分离的EPS基因簇：EpsA、EpsB、EpsC、EpsD，并且对该基因进行了克隆和测序。 

    本发明还提供了一种产胞外多糖嗜热链球菌的筛选方法。包括： 

 a.以传统发酵乳制品为样品，从中分离鉴定得到30株乳酸球菌；

b.经进一步理化鉴定确定嗜热链球菌菌株，并制得嗜热链球菌菌悬液；

    c.吸取所述嗜热链球菌菌悬液，以2%接菌量接种于200mL 12%脱脂乳中。置于43℃条件下进行18小时过夜培养，在4℃条件下打冷5-8小时，打冷后对各样品进行检测；