[发明专利]一种以酶为标靶的色谱筛选方法

说明书

(一)技术领域：

本发明属酶为标靶的分子筛选技术领域，特别是对酶蛋白活性要求不高的色谱分子筛选技术。

(二)背景技术：

酶为标靶的分子筛选技术目前国内外已广泛应用。酶作为分子标靶开展筛选，现有的方法主要是考察筛选对象对酶活的抑制作用，因此存在筛选过程对酶活要求高的问题。由于现有技术对酶活要求较高，为得到酶活高的样品，在筛选过程中往往使用的酶是从病人的病变组织中提取得到的，因而可提供筛选的酶量很少，成为主要制约因素。基因工程可克隆多种酶，但往往活性较低，按现有技术应用于筛选很困难。现有市售商品酶的酶活通常在10000活力单位/克左右，低酶活的酶通常无法从市售得到，也通常被认为低酶活的酶是无法应用进行筛选的。

本方法以筛选对象与酶蛋白的分子结合为考察依据，以活性不高的酶作为筛选标靶，依托前沿色谱技术筛选与酶具有亲合作用的目标化合物。

(三)发明内容

本发明的目的是得到一种标靶酶活低，但酶一级结构完整，可应用于筛选与酶具有亲和作用的化合物的前沿色谱筛选方法。本发明采用溶胶凝胶法固定酶，制成整体毛细管柱。以加热降低酶活，并测定酶一级结构未发生变化，应用酶活降低的酶制成整体毛细管柱进行本发明的筛选方法研究。

本发明采用的技术方案为：

一种以酶为标靶的色谱筛选方法，所述方法是以一级结构完整的低酶活且的酶用溶胶凝胶法制备成固定化酶整体毛细管色谱柱，再以固定化酶整体毛细管色谱柱筛选与所述固定化酶整体毛细管色谱柱中固定的酶有亲和作用的化合物，所述方法包括以下步骤：

(1)将四乙氧基硅烷与乙腈以体积比1∶2混合后，再加入四乙氧基硅烷质量2～3％的强酸性离子交换树脂，滴加入丙三醇，所述丙三醇与四乙氧基硅烷的物质的量之比为0.5∶1，在35～45℃下，搅拌混合72～120小时，然后过滤除去强酸性离子交换树脂，取滤液减压蒸馏，得到改性硅烷，所述改性硅烷中加入改性硅烷质量1.2～1.6倍的水和改性硅烷质量1.5～2.5％的1.0moL/L的磷酸溶液，混匀得到改性硅烷溶液；

(2)在浓度0.2moL/L、pH值为7.0～7.5的磷酸缓冲液中加入平均分子量为400～1500的聚乙二醇和低酶活的酶，配成含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液，所述含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液中聚乙二醇的浓度为200mg/mL，酶的浓度为90～150mg/mL，再加入体积为含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液体积的0.6％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，所得溶液与步骤(1)得到的改性硅烷溶液以质量比1∶1混合，搅拌均匀后得混合液，用注射器将所述的混合液注入预处理过的毛细管中，注满后静置3～10分钟，然后将玻璃毛细管浸入0.2mol/L、pH值7.0的磷酸缓冲液中，于3-～7℃下静置7～9天，制得固定化酶整体毛细管色谱柱；

(3)将与酶无亲和作用的苯酚样品通入含有待验亲和关系作用的酶的固定化酶整体毛细管色谱柱，控制流速4μL/m，可得到突破体积V₀；所述突破体积是流出曲线纵坐标达到最大值的一半时所消耗的样品液体积；将待筛选化合物用标准液配置浓度小于0.1mol/L的四种不同浓度的样品溶液，所述标准液的浓度为：0.05mol/L，pH 7.0磷酸缓冲液，0.1mol/L氯化四甲基铵；将四种样品溶液分别用注射泵注入含有待验亲和关系作用的酶的固定化酶整体毛细管色谱柱中，控制流速4μL/m，得到四种不同浓度样品溶液的突破体积V₁～V₄；若四种浓度各自的突破体积V₁～V₄相同，且小于V₀，表示待筛选化合物与固定化酶整体毛细管色谱柱中固定的酶无亲和作用；若V₁～V₄有差异，且都大于V₀，表示待筛选化合物与固定化酶整体毛细管色谱柱中固定的酶有亲和作用；

其特征在于，所述低酶活的酶为一级结构完整、酶活降低到原酶活的1～3％的酶。

进一步，本发明所述低酶活的酶为一级结构完整、酶活降低到原酶活的1～3％的胰蛋白酶，所述胰蛋白酶的原酶活为9000～12000活力单位/克。

本发明实施例中，采用模拟的方法降低酶活，采用的酶为经50～70℃加热20～40min的胰蛋白酶水溶液。但适用于本发明的酶不仅限于此，本发明还可利用根据基因工程克隆出来的活性较低的各种酶。