[发明专利]一种检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分析及传感领域，特别涉及一种基于水溶性共轭聚合物和核酸外切酶III检测脱氧核糖核酸(DNA)结合蛋白的荧光检测方法。

背景技术

脱氧核糖核酸结合蛋白是生物蛋白组中一类能够与序列特异性的脱氧核糖核酸发生结合并且产生重要功能的蛋白质，这类蛋白质在基因调控、基因重组、基因修复等细胞过程中发挥着重要作用，目前已成为功能基因组和蛋白质组研究的重要对象；许多疾病都与细胞内脱氧核糖核酸结合蛋白的异常相关。脱氧核糖核酸结合蛋白的检测分析是研究其功能的主要手段。因此，有关检测分析脱氧核糖核酸结合蛋白的研究一直受到科学界的高度重视。

目前用于研究脱氧核糖核酸与蛋白质相互作用的方法有很多，如凝胶迁移率分析法、印迹法等，虽然这些常规方法在脱氧核糖核酸结合蛋白的研究中发挥了重大的作用，但是这些技术工作量大、费时费力，并且操作过程中容易造成放射性物质污染。近年来，科学家们陆续报道了一些基于荧光染料的检测方法，如分子信标(Boon，E.M.；Salas，J.E.；Barton，J.K.，Nat.Biotech.2002，20(3)：282-286.)、荧光共振能量转移(Xu，X.；Zhao，Z.；Qin，L.；Wei，W.；Levine，J.E.；Mirkin C.A.，Anal.Chem.2008，80(14)：5616-5621.)等；以及基于纳米金的比色检测(Ou，L.J.；Jin，P.Y.；Chu，X.；Jiang，J.H.；Yu，R.Q.，Anal.Chem.2010，82，(14)，6015-24.)等，这些方法有效避免了放射性物质的污染，但是由于这些荧光探针需要双标记，给实验造成复杂化、分析效率低等缺陷。

发明内容

技术问题：本发明要解决的技术问题是针对现有的脱氧核糖核酸结合蛋白检测方法存在的不足，提供一种核酸外切酶III辅助的，共轭聚合物荧光信号放大的脱氧核糖核酸结合蛋白检测方法，其具有较高的特异性和高灵敏度。有望在临床诊断和生物医学中针对脱氧核糖核酸结合蛋白的药物筛选提供一种新的技术。

技术方案：本发明为一种基于水溶性共轭聚合物和核酸外切酶III检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法，运用该技术可以实现对脱氧核糖核酸结合蛋白表达和活化水平的检测分析，该技术的核心是利用水溶性共轭聚合物与荧光素标记的单、双链核酸之间不同的荧光共振能量转移效率(Huang，Y.Q.；Liu，X.F.；Fan，Q.L.；Wang，L.；Song，S.；Wang，L.H.；Fan，C.；Huang，W.，Biosensors and Bioelectronics 2009，24，(10)，2973-2978.)，以及脱氧核糖核酸结合蛋白在核酸特定位点处结合使其不被核酸外切酶III降解的技术巧妙地结合在一起，从而达到对脱氧核糖核酸结合蛋白表达和活化水平的高效分析。

本发明检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法基于水溶性共轭聚合物和核酸

外切酶III，包括以下步骤：

a.制备可特异性结合蛋白质的双链脱氧核糖核酸荧光探针；

b.将双链脱氧核糖核酸荧光探针与脱氧核糖核酸结合蛋白进行结合；

c.用核酸外切酶III对上述复合物进行酶切；

d.在上述的反应体系中加入水溶性共轭聚合物进行荧光检测。

步骤a制备的双链脱氧核糖核酸荧光探针为两条碱基序列反向互补的单链核酸分子A和B复性后形成的双链核酸分子。

所述的核酸分子A和B复性后形成的双链核酸分子，含有脱氧核糖核酸结合蛋白可识别并与之结合的核苷酸序列。

所述的核酸分子A的3′端含有5个突出的核酸碱基，以便核酸外切酶III作用于双链脱氧核糖核酸探针时，能从B的3′端开始降解。

所述的核酸分子B为5′端含有荧光素标记的核苷酸。

所述的步骤b将标记的双链脱氧核糖核酸探针与脱氧核糖核酸结合蛋白进行结合，是脱氧核糖核酸结合蛋白与双链脱氧核糖核酸探针间发生序列特异性识别并结合的过程。

所述的步骤c用核酸外切酶III对上述复合物进行酶切，是核酸外切酶III对核酸探针分子从双链脱氧核糖核酸的3′发生降解反应，逐个释放单核苷酸的过程。

所述的步骤d中的水溶性共轭聚合物的发射光谱与荧光素的吸收光谱有较好的重叠，以便发生高效的荧光共振能量转移；荧光共振能量转移效率用529nm和450nm处的荧光发射强度的比值来表示，即I_529nm/I_450nm。