[发明专利]革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR分析中用于内参基因扩增的引物序列

说明书

技术领域

本发明属于机理研究的分子生物学技术领域。特别涉及一种革胡子鲶(Clarias gariepinus)在养殖过程中与生长相关的重要内分泌因子——革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR分析中用于内参基因扩增的引物序列。

背景技术

革胡子鲶具有耐低氧能力强、生长快、疾病少等特点，是一种发展前景良好的水产养殖品种，在国内外养殖非常普遍。在食用价值上该鱼具有蛋白质含量高、营养丰富、肉味鲜美，刺少肉多的特点，并且具有滋补功效，对于手术伤口愈合有显著的辅助治疗作用。国内外对革胡子鲶的研究主要集中在人工繁殖和苗种培育、养殖模式及其养殖技术的研究，而对革胡子鲶的基础生物学方面的研究报道极少，主要有对其性激素、组织对氨的积累、对水中某些化学物质的组织病理学反应以及对水中重金属离子的积累等研究。而对革胡子鲶生长迅速、抗逆性强的机理的基础研究未见报道。

鱼类的生长与其他脊椎动物相同，是一个复杂的生物代谢过程，受基因型、激素、营养、环境等多方面的影响。对动物生长机理的研究其首选是从生长轴入手，生长轴是动物体内从下丘脑——垂体——靶器官的一系列激素及其受体所组成的神经内分泌系统。其中，生长激素(GH)是调控脊椎动物生长的重要内分泌因子，也是研究动物生长最重要的因子。GH除了对鱼类的生长有很强的促进作用外，同时对鱼类的免疫系统、生殖生理及海水适应性也有着重要的影响。此外还有研究显示GH基因多态性与动物的生产性能有关。

从鱼类生长轴中的关键因子GH入手，通过GH基因表达的实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)分析，探讨高密度养殖革胡子鲶快速生长的机理。对于基因表达的qPCR分析，既要有拟分析的目标基因，又要有适宜的内参基因。常用的内参基因有beta-actin、18S rRNA和GAPDH基因。在qPCR中，引物序列对产物的特异性和有效扩增来说至关重要。只有适宜的寡核苷酸序列，在qPCR中同时满足下述3个条件：第一，利用较高浓度cDNA(如反转录后稀释5～10倍的cDNA)在进行qPCR时C_T值应小于18～20；第二，每个反应的熔解曲线应为1个峰；第三，通过建立标准曲线得出的扩增效率应在90～105％(标准曲线的R²值应大于0.98，重复样本C_T值的标准差应≤0.5)。此时的寡核苷酸序列才能作为qPCR的引物。

尽管qPCR技术已经成熟，目前已成为不同样本间进行基因表达水平定量差异比较的权威性方法。在过去的10年间，该方法迅速流行，出版的文章超过2万余篇，涉及医学、环境和农业研究。但在应用此技术的实验过程中，需要研究人员自己设计并检测引物是否可用于qPCR。

目前没有革胡子鲶相关目标基因表达qPCR分析适宜的引物核苷酸序列，特别是用于内参基因扩增的引物核苷酸序列。

发明内容

本发明目的是提供一种革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR(qPCR)分析中用于内参基因扩增的引物核苷酸序列，提供有利于对革胡子鲶生长迅速的机理的基础研究的工具。

本发明设计并检测了2对目标基因(GH)和4对内参基因(beta-actin和18S rRNA各2对)引物序列，其中1对目标基因和2对内参基因的引物符合qPCR的要求。本发明的优点在于内参基因扩增的引物应用广，不仅可以用于革胡子鲶的GH基因表达分析，理论上可用于该种鱼类的任一基因的qPCR分析；此外，GenBank检索认为，申请的2对内参基因的扩增引物，还可用于其他一些鲶形目鱼类的基因表达的qPCR分析。这一发明为革胡子鲶以及几种鲶形目鱼类的基础研究奠定了基础。

本发明具体内容

一种革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时用于内参基因(18S rRNA)扩增的2对引物的核苷酸序列，其特征见表1

表1申请专利的引物核苷酸序列信息

表中的两对引物不仅可作为革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时内参基因(18S rRNA)的扩增引物，而且可作为革胡子鲶所有待检目标基因表达qPCR分析时，以18S rRNA为内参基因的扩增引物。

表中的两对引物不仅可应用于革胡子鲶的研究，还可应用于其它一些鲶形目鱼类的待检目标基因表达qPCR分析时以18S rRNA作为内参基因的研究。

革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时用于内参基因(18S rRNA)扩增的2对引物核苷酸序列的制作方法：

一、总体RNA的提取