[发明专利]抗肿瘤活性蛋白TB-1在其制备抗肿瘤药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤活性蛋白在其制备抗肿瘤药物中的应用。 

技术背景

蛋白质是构成生命的物质基础，由20多种氨基酸组成。是机体细胞和组织重要组成部分。天然果蝇蛹蛋白TB-1蛋白是一种通过高通量筛选出的具有特殊生物活性的蛋白质，进入人体后主要发挥较强抗肿瘤、抗病毒等药理作用，通过已进行的实验得出该蛋白抗肿瘤的作用机理主要是通过抑制肿瘤细胞生长、增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，可诱导系列抗肿瘤相关基因表达，涉及多个信号通路，与细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、抗炎免疫、抗原识别和提呈、抗病毒等有密切关系。 

然而从果蝇蛹中直接分离纯化，获得该蛋白产量很低，而且提取纯化过程相当复杂。已完成构建高产TB-1蛋白的异源微生物高效表达，实现该蛋白的工业微生物发酵生产，为后续临床前试验提供充足的TB-1蛋白。 

当今肿瘤疾病已经成为威胁人类健康及生命的主要疾病，其死亡人数仅次于心脑血管病。鉴于今年类国内为医学界对肿瘤疾病发病机理进行的深入研究，对肿瘤的发病机制进一步的理解，人们利用各种途径来研究和开发具有高特异性，对肿瘤细胞高杀伤性而对正常细胞无毒副作用的药物。本发明所涉及蛋白具备上述优势，无疑为我国研制和生产具有完全自主知识产权的重组抗肿瘤蛋白新药奠定良好的基础具有重大意义。 

发明内容

本发明提供一种抗肿瘤活性蛋白TB-1，在一些肿瘤细胞中表现出较高抑制肿瘤生长作用，并对正常细胞表现出较低的毒性和良好的水溶性。 

本发明还提供所述抗肿瘤活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。 

所述抗肿瘤活性蛋白TB-1，外观为白色粉末状，该蛋白理化性质为：直链蛋白，带糖链，有beta 1，4糖苷键特异性并可被Schiff’s试剂染色。分子量：46.5kDa。等电点：7.8、温度：65度以上失活、pH：4-8内稳定、金属离子：Fe³⁺and Mn²⁺在浓度3-12nM时候会使其失活，其他没有影响。 

本发明所述抗肿瘤活性蛋白TB-1为毕赤酵母工程菌所表达。 

本发明的实验证明，TB-1蛋白是通过激活Caspase-3信号通路以及诱导细胞凋亡的途径抑制肿瘤细胞生长；在以人乳腺癌细胞株MCF-7、人白血病细胞株K562、人肝癌细胞株Hep-G2、人肺癌细胞株SPC-A-1为靶细胞的MTT还原法检测抗肿瘤活性试验中，TB-1蛋白的50％抑制浓度IC₅₀分别为3.5、2.0、4.8、5.2μM，而对正常人成纤维细胞HLF生长未见明显抑制。表明活性蛋白TB-1可用于制备抗肿瘤药物。 

附图说明

图1为本发明纯化后抗肿瘤活性蛋白TB-1SDS-PAGE电泳图，泳道U：TB-1蛋白、泳道M：Marker； 

图2 CASPASE-3标准曲线图； 

图3 Hoechst 33258的吸收光谱和发射光谱图，左侧峰为吸收光谱，右侧峰为发射光谱； 

图4为TB-1蛋白诱导细胞凋亡荧光染色结果，图4-1MCF-7对照组细胞、图4-2部分出现染色质固缩的凋亡细胞，在荧光显微镜下用紫外光激发经过40μg/ml TB-1蛋白处理48小时后的人乳腺癌细胞MCF-7和对照组细胞，并进行了观察，结果表明：对照组细胞(未经MPL药品处理)没有出现明显的形态学改变的迹象；而部分受试细胞则显示出了染色质固缩、边缘化的典型的细胞凋亡特征； 

图5为TB-1蛋白作用于肿瘤细胞及正常细胞对比图，经过TB-1蛋白的处理肿瘤细胞株K562及MCF-7均受到明显抑制，人正常成纤细胞HLF并未受到明显抑制作用。 

具体实施方法 

1.抗肿瘤活性蛋白TB-1的制备