[发明专利]一种莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法

说明书

技术领域    

本发明属于基因工程领域，具体地说涉及一种莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法，该菌株可用于发酵生产莽草酸。

背景技术

莽草酸（Shikimic acid，Shikimate），化学名[3R-(3α,4α,5β)]-3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸，是生物体内代谢过程的中间产物，也是合成许多生物碱、芳香氨基酸与吲哚衍生物、手性药物（如抗病毒药）的原料，广泛存在于植物及微生物中。

莽草酸通过影响花生四烯酸代谢，抑制血小板聚集，抑制动、静脉血栓及脑血栓的形成，莽草酸不仅具有抗炎、镇痛作用，还可以作为抗病毒和抗癌药物中间体。莽草酸的一些衍生物也具有一定的药物作用。

以莽草酸为原料合成的“达菲”是世界卫生组织推荐的防治高致病性禽流感药物，也是目前唯一证实有效治疗禽流感药物。禽流感暴发以来，世界对“达菲”的需求急剧扩大。我国政府和企业都在分别加紧进行抗禽流感药物的储备和生产，但因生产“达菲”的主要原料——莽草酸产量的不足，严重限制了“达菲”的生产。

目前，莽草酸的制备方法主要有三种，分别是植物组织提取法、化学合成法和微生物发酵法。莽草酸大量存在于高等植物和微生物中，如八角果含莽草酸8%～13%，是各类已研究植物种类中莽草酸含量最高的，也是工业化生产莽草酸最常用的原料。但由于毒八角果内含有剧毒物质，其挥发油会引起麻痹，提取莽草酸时需要经过严格处理才能够达到环保要求，生产成本较高。虽然从植物中提取莽草酸具有简单方便、技术限制较少等优点，而目前的莽草酸也多是从八角茴香等植物组织中提取而来，但是该方法受原料产量限制，无法大量生产。此外随着八角茴香价格的提高，莽草酸成本也随之上升。化学合成方法因较多使用有机和有毒试剂，不能被大量应用于莽草酸生产。微生物发酵法因较少受到原料来源的限制，容易持续工业化生产，对环境污染较少，成本低廉，逐渐被应用于莽草酸生产。

莽草酸循环广泛存在于微生物中，通过微生物发酵也能够提取莽草酸。在大肠杆菌中葡萄糖转化为芳香族氨基酸（L-苯丙氨酸、L-赖氨酸和L-色氨酸），而莽草酸为中间产物。普通大肠杆菌经过改造后可以积累莽草酸。罗氏公司2005年与德国一家生物技术中心合作，通过向一种无害的大肠杆菌超量补给葡萄糖，迫使细菌释放莽草酸。目前，罗氏公司三分之二的莽草酸取自八角茴香，余下三分之一由发酵法提供。

在生物体的自身代谢中，莽草酸难以大量积累。莽草酸作为中间代谢物，一旦合成就被会被用于其它生物分子特别是芳香族分子的合成。因而生物的原生代谢必须被打破才可能积累莽草酸。与莽草酸合成相关的酶有3-脱氧-D-阿拉伯-庚酬-7-磷酸合成(3-deoxy-7-phosphohep tulonate synthase，简称DAHP合成酶，催化DAHP的合成)、3-脱氢奎尼酸合成酶(3-dehydroq uinate synthase，催化由DAHP到3-脱氢奎尼酸的反应)、3-脱氢奎尼酸脱水酶(3-dehydroquinate dehydratase，催化3-脱氢奎尼酸脱水生成脱氢莽草酸)、莽草酸脱氢酶(shikimate dehydrogenase，催化脱氢莽草酸向莽草酸的转变，该反应可逆)和莽草酸激酶同工酶(shikimate kinase isozyme，催化莽草酸磷酸化为3-磷酸莽草酸)。它们在大肠杆菌中分别由aroF（aroG，aroH），aroB，aroD，aroE，aroK（aroL）编码，其中aroF、aroG和aroH均编码DAHP合成酶（aroF受酪氨酸反馈抑制，aroG受苯丙氨酸反馈抑制，aroH受色氨酸反馈抑制），aroK和aroL都编码莽草酸激酶同工酶，它将莽草酸转化为3-磷酸莽草酸(shikimate-3-phosphate)。由于和莽草酸合成相关酶并不足以进行大量积累莽草酸的催化，莽草酸激酶催化莽草酸向其它化合物的转化，因此生产菌株必须进行相关酶的改造以适合莽草酸的大量合成。