[发明专利]一种基于纳米金增强的多种肺癌标志物的高灵敏检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于纳米金增强的多种肺癌标志物的高灵敏检测方法，特别是一种基于微阵列、纳米生物复合探针及纳米金增强的高灵敏检测方法，该方法能同时检测多种肺癌相关标志物，可用于肺癌的早期检测、复发及转移监测。属于纳米生物检测技术领域。

背景技术

能够对生物分子简便、快捷、高灵敏度地检测，始终是人们努力的方向，在疾病的早期诊断、快速诊断、卫生检测、环境监测等领域都具有重要意义。肺癌是全球发病率最高、死亡总人数最多的恶性肿瘤，肺癌也是预后最差、容易转移的恶性肿瘤之一，肺癌起病隐匿，早期无临床症状。现有影像学检测和痰细胞学检查等检测手段，即使最先进的检测技术如多层螺旋CT和正电子发射体层摄影等可以发现直径约2-6mm的肿瘤，但检查过程复杂，花费很高，且此时肿瘤已经进入血管生成期，因此，现有的检测技术显然仍无法用于肺癌早期及转移检测。随着分子生物学和医学研究的深入，出现了许多肺癌标志物，主要有癌胚抗原、细胞角蛋白、p53蛋白、黏蛋白等。总体来说，肺癌标志物含量低，单一标志物很难同时满足敏感性和特异性的要求。随着纳米技术的飞速发展，已可以同时实现多种肺癌标志物的高灵敏检测，这导致早期肺癌及转移肺癌的敏感和特异检测成为可能。

微阵列是利用微电子芯片技术的集约化和平行处理原理，将大量具有生物学意义的生物样品有序地固化在硅衬底或玻璃上，利用微阵列可以快速地获取或处理大量的生命信息。微阵列的信号标记通常采用荧光标记检测法，而荧光试剂价格昂贵、以及生物分子自身荧光干扰、荧光衰减以及读取所用仪器价格昂贵等缺点，也大大限制了其在医学临床诊断方面的应用。随着纳米科学技术的不断发展，纳米材料和纳米结构取得了引人瞩目的成就。纳米材料具有传统材料所不具备的特有的三大效应：表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应。作为标记材料纳米材料和纳米结构已广泛应用于免疫检测中。如纳米金颗粒对生物分子有很强的吸附功能，可以与蛋白质、核酸等非共价结合，因而在生物医学基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。纳米金颗粒具有高电子密度的特性，在纳米金颗粒结合处，在显微镜下可见褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而广泛应用于定性或半定量的快速检测方法中，但是这类检测技术的最大缺点是灵敏度低，检测蛋白的灵敏度仅为ng/ml，对微量生物分子检测无能为力(免疫标记技术的进展及纳米技术在其中的应用，贾春平等，生命科学，第20卷，第5期，第749-753页)。此外，这类检测方法大部分适用于试纸条或膜为固相载体的检测体系中，对于以玻璃等为固相载体的微阵列上的微米甚至纳米级的检测点来说，不经过进一步的信号放大，一般显微镜尤其肉眼根本是检测不到的，需要进一步进行纳米金信号的放大。本发明就是在基于以上的需求提出的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于纳米金生物复合探针、微阵列及纳米金增强的高灵敏检测方法，该方法能同时高灵敏检测多种肺癌标志物。

本发明主要内容包括：首先将待测蛋白的捕捉抗体点样到微阵列上，然后在纳米金上标记待测蛋白的多克隆或单克隆检测抗体，然后将标记好待测蛋白质单克隆或多克隆捕捉抗体的蛋白微阵列及纳米金生物复合探针与待测蛋白质样品混合，37℃孵育一段时间，洗去没有反应的纳米金探针，加入金增强反应液，肉眼或显微镜下观察、或用CCD扫描拍照，根据灰度值测定相应的蛋白浓度。

本发明的方法步骤：

(1)蛋白抗体微阵列制作

用芯片点样仪将各待检测蛋白质的抗体及质控点(二抗)点在醛基修饰的玻璃基片上，具体点样方法参见专利(200710170613.X)，室温放置16小时以上，置4℃保存。

(2)构建纳米金生物复合探针

在pH6～9情况下，纳米金颗粒水溶液与待测蛋白质相对应的抗体结合，根据胶体金凝集实验确定各抗体的用量，将各抗体与纳米金溶液室温条件下混匀一段时间，再加入一定浓度(0.1％-20％)(质量/百分数，下同)的聚乙二醇，4℃过夜，离心，洗去未标记上的抗体，用纳米金重悬液(牛血清白蛋白BSA 0.25-10％、聚乙烯吡咯酮PVP 0.1-1％、蔗糖1.5-10％、聚乙二醇PEG0.01-1％、吐温Tween20 0.2-1％)重悬标记好的纳米金生物复合探针，置4℃保存备用。

(3)免疫反应

将标记好各待测蛋白抗体的芯片及纳米金生物复合探针与待测蛋白质样品混合，37℃孵育一段时间，然后再洗去没有反应的纳米金探针。

(4)显色