[发明专利]农杆菌介导的玫瑰遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种以‘唐白’品种为例，以继代增殖的体细胞胚为转化受体材料，通过农杆菌介导进行玫瑰遗传转化的方法。

背景技术

玫瑰(Rosa rugosa)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)落叶直立丛生灌木，原产中国北部，其色艳花香，含油量高，是我国重要的经济植物，也是世界上重要的观赏与生产两型花卉之一。但玫瑰一年只开一次花，且花期不长，无法满足市场的需由。采用传统的杂交育种的方法选育新品种，周期长，工作量大，并且会受到育种材料自身变异的限制，改良幅度有限。随着生物技术的快速发展，植物细胞工程和基因工程技术日趋成熟，可以在保持品种的其他性状相对稳定的基础上，利用外源基因对其所控制的性状进行定向改良，提高了育种的效率，从而为培育玫瑰新品种提供了新的途径。

玫瑰遗传转化的研究是基因工程育种的基础，但是目前国内外还没有玫瑰遗传转化成功的报道。

华中农业大学的专利申请“玫瑰再生为完整植株的方法”(申请号为：201110099811.8)，提出以玫瑰未成熟叶片为外植体，通过体细胞胚发生途径，建立玫瑰再生体系的方法，但其不具有遗化转化步骤，无法实现品种改良。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种以玫瑰未成熟叶片为外植体，以体细胞胚为转化受体，通过农杆菌介导的玫瑰遗传转化的方法，，具有方法简单、培养周期短的优点。

本发明的农杆菌介导的玫瑰遗传转化方法，以玫瑰未成熟叶片诱导得到的体细胞胚为受体，通过农杆菌介导的方法，按下述步骤进行处理：

(1)体细胞诱导：以玫瑰未展开带叶柄小叶为外植体，将其接种于体细胞胚诱导培养，直接诱导出体细胞胚；

(2)转化受体的继代增殖培养：将诱导得到的体细胞胚接种于体细胞胚继代增殖培养基中继代增殖培养，为遗传转化提供转化受体材料；

(3)遗传转化：将经继代增殖培养的体细胞胚作为转化受体材料转入制备好的农杆菌菌液中进行侵染，所述侵染时间为50-60min；

(4)然后将侵染后的体细胞胚进行共培养，选择增殖培养、选择萌发成苗培养，最终获得玫瑰的转基因植株。

步骤(1)中所述体细胞胚诱导培养基包括：MS培养基为基础培养基，并添加2，4-D 3.0-4.0mg/L、葡萄糖30.0g/L、GEL 3.0mg/L，加蒸馏水至1L，pH 6.0。

步骤(2)中所述体细胞胚继代增殖培养基包括：MS培养基为基础培养基，并添加2，4-D 1.0mg/L、葡萄糖30.0g/L、GEL 3.0mg/L，加蒸馏水至1L，pH 6.0，每4周更新一次培养基，并选择在更新的体细胞继代增殖培养基中培养了2周的体细胞胚作为遗传转化的受体；所述培养条件为：温度24±2℃、光照强度为50-100lx。

所述步骤(3)中侵染时间为60min。

所述步骤(4)中，先将侵染后的体细胞胚转入共培养培养基中，在24±2℃、黑暗条件下进行共培养，共培养2天后转入体细胞胚选择增殖培养基在24±2℃、光照强度为50-100lx条件下进行选择增殖培养10周，每2周更新一次培养基，筛选得到抗性体胚；将在选择增殖培养基中筛选得到的抗性体胚转入选择萌发成苗培养基中，每三周更新一次培养基，在24±2℃、光照强度为1000-1500lx下萌发成苗，最终获得玫瑰的转基因植株。

所述共培养培养基包括：MS培养基为基本培养基、添加2，4-D1.0mg/L，AS 100μmol/L，葡萄糖30.0g/L，GEL 3.0mg/L，加蒸馏水至1L，pH 5.8；所述体细胞胚选择增殖培养基包括：MS培养基为基本培养基，并添加2，4-D 1.0mg/L，Km75-100mg/L，Cef300mg/L，葡萄糖30.0g/L，GEL 3.0mg/L，加蒸馏水至1L，pH 6.0；所述选择萌发成苗培养基包括：1/2MS培养基为基本培养基，并添加BA1.0，Km 75mg/L，Cef 300mg/L，葡萄糖30g/L，GEL 3.0mg/L，加蒸馏水至1L，pH 6.0。

所述的Km是卡那霉素(Kanamycin)：用无菌蒸馏水配制成100mg/L的母液，Cef是头孢霉素(Cefotaxime)：用无菌蒸馏水配制成200mg/L的母液，AS是乙酰丁香酮：称取一定量的AS，用甲醇溶解，最后用无菌蒸馏水定容，配制成10μmol/ml的母液，以上三种生化试剂均采用0.45μm滤膜过滤灭菌，于-20℃保存；