[发明专利]一种血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于酶联免疫分析 ( enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 技术，具体涉及一种检测血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子活性的试剂盒，采用抗血小板糖蛋白（glycoprotein，GP）Ibα单克隆抗体( monoclonal antibody，mAb) SZ-151作为包被抗体来捕捉结合真核表达重组人GPIbα氨基端His¹-Val²⁸⁹片段的-Fc融合蛋白（rfGPIbα H1-V289-Fc），再捕获血浆中的血管性血友病因子（VWF），然后应用酶标检测仪检测血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子活性。

背景技术

血管性血友病因子（von Willebrand factor, vWF）是一种大分子量的具有粘附功能的多聚体糖蛋白，在初期止血过程中发挥着重要怍用。它既可与血小板受体糖蛋白（GP）Ib/IX/V、GPⅡb/Ⅲa结合，又能与胶原等细胞外基质(ECM)结合，从而介导血小板的粘附与聚集。而且vWF还能与凝血因子Ⅷ结合，保护因子Ⅷ免受APC灭活。vWF量的减少或质的异常均能导致血管性血友病(von Willebrand’s diseases, vWD)的发生。

血管性血友病(von willebrand’s disease，vWD) 是最常见的一种遗传性出血性疾病， 国外文献报道vWD发病率为0.1%-1%，其发病机制为患者的vWF基因突变，导致血浆中vWF 数量减少或质量异常。vWD主要分为3型，其中1型与3型为量的减少，2型为质的异常。2型又可进一步分为四种亚型(A，B，M和N)。（1）2A型为vWF前体装配异常或对蛋白水解酶的敏感性增加导致缺乏vWF高、中分子多聚体缺乏；（2）2B型发病机制为vWF与血小板膜GPⅠb亲和性增加以致自发结合，导致血小板聚集、减少，vWF清除加速，特征为缺乏vWF高分子多聚体；（3）2M型是由于vWF基因A1区突变，导致对血小板膜GPⅠb亲和性降低，vWF多聚体分析正常；（4）N型特征为vWF基因D′区或D3区突变，导致与因子Ⅷ亲和力降低，血浆FⅧ失去保护而被降解。

在大部分国家，疑似vWD患者的筛查试验包括：出血时间(BT)，vWF抗原水平 (vWF:Ag) 和vWF瑞斯托霉素辅因子活性试验(vWF:RCof)等。要做出准确、恰当的治疗尚需结合其他分型试验如瑞斯托霉素诱导的血小板聚集（RIPA）、胶原结合试验(vWF:CB)、vWF多聚体凝胶电泳和基因分析等。现有实验室检查方法各有一定局限性，因此不能仅凭单项实验做出可靠的诊断，需组合应用一系列检测方法才能较好地对vWD进行筛查、诊断和分型。vWF:Ag试验可较好的反映vWF量的异常但无法体现出vWF质的缺陷，其结果有助于诊断所有3型和大部分1型患者，由于部分2型患者vWF:Ag水平可能正常，因此该实验仅能辅助诊断部分2型患者。对于2型患者，反映vWF功能的主要试验vWF:RCof 就变得尤为重要。

瑞斯托霉素是一种抗生素，可诱导vWF 和血小板GPIb/V/IX 复合物的结合。已证实与vWF的A1区结合的部位为血小板GPIbα氨基末端分子量42kD的片段(H1-V289)。国内目前主要应用血液凝集仪检测vWF：Rcof，该方法需使用血小板聚集仪，其主要将固定正常血小板，患者血浆及一定浓度瑞斯托霉素混合，测定血小板凝集情况。由于该方法使用固定的正常血小板，存在重复性较差、批内变异和批间变异都较大的固有缺点，且血小板聚集程度有时难以判定，因此常导致部分vWD患者的误诊。

2000年Vanhoorelbeke 等 首次报道了应用抗GPIbα单克隆抗体2D4包被96孔聚苯乙烯酶标板，加入重组的GPIbα，在小剂量瑞斯托霉素存在下建立了血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子活性测定的酶联免疫分析（vWF:Rcof –ELISA）；国内2007年徐海燕等应用该进口抗体2D4也报道了该方法：vWF:Rcof-ELISA法建立，以抗GPIba的 单克隆抗体2D4为包被抗体，捕获重组的GPIba氨基端片断(v GPlba)，该片段在瑞斯托霉素存在的情况下与vWF结合（参见：徐海燕. 血管性血友病分型组合实验的建立和临床应用. 《苏州大学》2007年硕士论文）。

但是，现有技术中至今未见商品化的vWF:Rcof –ELISA诊断试剂盒。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子酶联免疫试剂盒。