[发明专利]净化三聚氰胺的免疫亲和色谱柱及用其净化三聚氰胺的方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种三聚氰胺免疫亲和色谱柱的制备和使用方法，属于免疫亲和层析及三聚氰胺检测技术领域。

背景技术

近年来频频发生的在食品和饲料中违法添加三聚氰胺而导致的中毒事件引起了广泛的关注。尤其是2008年我国的三鹿奶粉事件使得食品安全问题成为国家和人民关注的新焦点。三聚氰胺（MEL）是一种用途广泛的有机化工原料，其主要用途是用来生产三聚氰胺甲醛树脂，用以制造涂料、模塑粉、装饰面板等。目前，对奶粉等食品中蛋白质的测试方法通常采用“凯氏定氮法”，其原理是通过测出总含氮量来间接推算出蛋白质的含量。三聚氰胺分子含氮量高达66%，最重要的是，三聚氰胺是一种无色，无味的白色结晶粉末，掺杂后不易被发现，而且成本低廉，在巨大利益的驱动下，三聚氰胺这一化工原料被一些不法商贩添加到奶粉及其他食品中以牟取暴利。

毒理学研究表明，三聚氰胺是一种低毒或微毒的化学物质，但如果长期摄入会对动物泌尿系统造成损害，其作用的靶器官为肾脏，从而导致膀胱癌和结石的发生。其机理在于三聚氰胺和其水解产物三聚氰酸在肾脏可形成一种不溶于水的大分子的网络结构复合物，这种复合物不能透过肾小球，当沉积下来后就会形成结石，造成肾小管的物理性阻塞，尿液无法排出，最终导致肾结石甚至肾脏衰竭，这也与2008年的“三鹿奶粉事件”中那些受害婴儿所表现的“肾结石”症状相一致。

目前，三聚氰胺的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱质谱法（GC-MS）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）等，但这些方法前处理过程均比较繁琐，如GC法需要衍生化，过程复杂，后经常规的SPE柱净化和分离，存在着净化效果差，有机溶剂掺杂，所需时间长等缺点。免疫亲和技术是90年代在分析领域发展起来的新技术，免疫亲和柱（IAC）是利用免疫亲和层析原理制作的分离分析预装柱，由于抗原与抗体作用的高度特异性，待测样品通过IAC柱后能有效，快速，灵敏，准确的去除绝大部分杂质从而净化富集目标物。但是，用免疫亲和柱净化基质中的三聚氰胺未见报道，更无商品化的IAC柱出售。

发明内容

本发明的目的是提供一种净化三聚氰胺的免疫亲和色谱柱，及由其为主组成的净化三聚氰胺的试剂盒，得到被测样品中所含的净化的三聚氰胺溶液，用于后续仪器分析样品中三聚氰胺含量。

本发明的技术方案：一种净化三聚氰胺的试剂盒，由净化三聚氰胺的免疫亲和色谱柱，三聚氰胺标准溶液，淋洗液，洗脱液，再生液，平衡保存液和海绵托架所组成；

所述净化三聚氰胺的免疫亲和色谱柱是将三聚氰胺单克隆抗体包埋于固相载体上而后作为填料装柱而成；

所述的三聚氰胺单克隆抗体是以三聚氰胺为半抗原与载体蛋白偶联而成的完全抗原为免疫原得到的三聚氰胺鼠单克隆抗体；

“一种三聚氰胺人工抗原的合成方法”已获中国专利ZL200810234130.6，授权公告号CN101402683B，公告日2011年3月30日。

所述固相载体为四甲氧基硅烷（TMOS）；

所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白； 

所述淋洗液为0.01M，pH7.4，含0.05% Tween-20的PBS溶液；

所述洗脱液为甲醇-甘氨酸盐酸溶液，甲醇:甘氨酸盐酸溶液v:v为1:1；甘氨酸盐酸溶液为甘氨酸7.5g，12mol/L HCL 10mL，用高纯水定容至500mL，甲醇500mL；

所述再生液为含0.01% 叠氮钠、含0.05% Tween-20的0.01M，pH7.4的PBS溶液；

所述平衡保存液为0.01M，pH7.4的PBS溶液。

所述PBS缓冲液为1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，十二水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g。

用所述的净化三聚氰胺的试剂盒净化样品中三聚氰胺的方法，步骤为：

1）样品的前处理：参照国家标准GB/T 22388-2008：称取1g的奶粉样品于50mL塑料离心管中，加入8mL三氯乙酸和2mL乙腈，超声提取10min，再震荡提取10min，然后以不低于4000r/min离心10min，取上清液，经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤，取滤液；

2）净化：免疫亲和色谱柱使用前用10mL的PBS平衡保存液平衡；然后将步骤1）得到的滤液通过所述的免疫亲和色谱柱层析；然后用所述的淋洗液及超纯水洗涤，再用所述的洗脱液洗脱，收集洗脱液经0.22μm孔径的聚四氟乙烯膜过滤后即可得到净化的三聚氰胺溶液，用于后续仪器分析样品中三聚氰胺含量。