[发明专利]一种甲胎蛋白的均相时间分辨荧光分析方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分析化学、纳米生物技术领域，具体涉及生物物质的免疫测定法。

背景技术

人体甲胎蛋白(AFP)来源于胎儿的糖蛋白，分子量约为70KDa，成人的甲胎蛋白可由恶性肿瘤产生，特别是肝癌和胚胎细胞肿瘤，70-95％的原发性肝癌患者血清中AFP含量有明显升高，在肝炎和肝硬化的患者中甲胎蛋白也常有轻微的升高。

因此，对AFP的临床分子诊断显得十分重要，其中的最低灵敏度检测对及早发现肿瘤并制定治疗方案尤为重要。目前，测定AFP免疫检测方法较多，最常用的血清检测方法有：酶免疫法(EIA)、放射免疫法(RIA)、化学发光法以及时间分辨免疫荧光分析法(TRFIA)。其中，酶标法为半定量试剂，在准确性、灵敏度上存在很大的局限性，并且对于酶的活性极易受标记反应以及温度、pH值及溶液中离子浓度等因素的影响、线性范围窄、费事等缺点；放射性免疫法操作带放射性以及标志物放置时间短，试剂有效期较短等缺点；化学发光法的优点是灵敏度高、线性范围宽、分析时间短，但它的缺点：化学发光的产生通常是瞬间完成的，发光峰值很快衰减，而且成本较高；温度和pH值对发光有很大影响等，这些因素影响了该类方法的进一步使用。TRFIA以稀土离子作为标记物，具有制备简便、储存时间长、无放射性污染、重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点；但是，因为需要冲洗未标记物，操作较为繁琐，很难高通量化和微量化。

这些方法为非均相分析方法，虽然其检测性能也都能满足临床要求，但灵敏度相对依然较低。非均相分析方法一般是在一个固定的平台上反应，然后，通过冲洗的方法将游离而未参与免疫反应的标记物除去，然后检测剩余的有效标记物。伴有冲洗的方法，不仅可能破坏有效标记物，而致使灵敏度不高，不仅费事，操作也较为繁琐，很难高通量化、自动化和微量化。

而均相时间分辨荧光分析就可以克服这些缺点，分析操作简单，不需要洗涤分离游离标记物，分析速度快，易自动化等优点，在生物分析领域其应用越来越广泛。

现有均相时间分辨荧光分析(HTRFA)技术，能量供体与受体是一对一的分子相互作用形成能量转移，从而实现定性定量分析。其技术难题在于：一对一的分子能量共振能量转移(FRET)效率很低，供体的能量不能充分利用，其灵敏度受到一定的限制。导致FRET效率低下还有一个原因就是，目前这些分析方法用到的能量受体是荧光素(fluorescein)、青色素(cyanine，cy)，亚历克撒染料(Alexa)，藻红蛋白(phycoerythrin，PE)或别藻红蛋白(allophycocyanin，APC)等有机染料。尽管有机染料已使用数十载，然而，众所周知，有机染料致命的缺点就是光谱的Stock位移比较短，荧光发射峰不对称且有明显拖尾，最致命的是抗光漂白性极差，使得基于荧光值分析测试方法的生物分析，尤其是HTRFA很不稳定，效率低下，间内和间外分析偏差较大。因此，有机染料并非HTRFA能量受体的最佳选择。另一方面，现有HTRFA技术得以实现归功于稀土金属螯合物的使用，一般的能量供体是稀土金属铕螯合物，要求能量受体发射近红外波(比如665nm)，这需要昂贵的近红外敏感检测器件。即使使用铽螯合物，由于大多数有机染料荧光发射光谱宽而且有明显拖尾，与铽螯合物时间分辨荧光谱有较大重叠，仅适合在长波长或近红外波段进行分析，对昂贵的近红外敏感检测器要求依然存在。

因此，为弥补现有技术的不足，需改变现有技术能量配体一对一的方式，采用一个能量供体同时向数个能量受体同时进行时间分辨能量转移。更需要寻求一种具有新奇的光学特性的能量受体：其光谱的Stock位移比较宽，荧光发射峰对称且无明显拖尾，更重要的是抗光漂白性极强，而且该能量受体不依赖于昂贵的红敏检测器。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种甲胎蛋白的均相时间分辨荧光分析方法，该方法特异性强和检测灵敏度高。

本发明解决上述问题采用的技术方案是，

一种甲胎蛋白的均相时间分辨荧光分析方法，该方法由以下步骤组成：

(a)定量标准曲线制备：将HFRFA能量受体、HFRFA能量供体和甲胎蛋白标准品一起孵育，进行均相时间分辨荧光检测和分析，得到甲胎蛋白浓度与荧光值的标准曲线；

(b)样品检测：将HFRFA能量受体、HFRFA能量供体和待测甲胎蛋白样品一起孵育，进行均相时间分辨荧光检测和分析，将检测样品得到的荧光值与步骤(a)得到的标准曲线比较计算待测甲胎蛋白样品浓度；

其中，