[发明专利]神经干细胞培养扩增方法及所用培养基

权利要求书

1.一种神经干细胞培养扩增方法，所述方法包括：

(a)将神经干细胞接种在包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的DMEM或DMEM/F12培养基中培养2、3或4天；

(b)添加5-20％体积的营养补充液并继续培养，其中所述营养补充液是包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mM的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mM的丙酮酸钠，0.5-1.5mM的N乙酰半胱氨酸(NAC)，50-150ng/ml的bFGF，50-150ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的白血病抑制因子(LIF)的DMEM或DMEM/F12培养基；

(c)监测培养基中形成的神经球直径，当60％以上、优选70％以上神经球直径高于阈值时，分离直径高于所述阈值的神经球，消化后收获，其中所述阈值为200-500μm，例如为250μm、300μm、350μm、400μm或450μm；

(d)留在原培养基中的直径小于所述阈值的剩余细胞在将培养基移除1/2-1/4体积并添加与移除体积相同体积的(a)中所述的包含bFGF和EGF的培养基后继续培养；

(e)在(a)接种神经干细胞后第10、11、12、13、14或15天通过合并(c)收获的细胞和(d)继续培养所得的细胞而收获细胞。

2.权利要求1的方法，其中(a)的培养基为包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mM的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mM的丙酮酸钠，0.5-1.5mM的NAC，5-30ng/ml的bFGF，5-30ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的LIF的DMEM或DMEM/F12培养基。

3.权利要求2的方法，其中(a)的培养基中bFGF的浓度为16-24ng/ml，例如20ng/ml。

4.权利要求2的方法，其中(a)的培养基中EGF的浓度为16-24ng/ml，例如20ng/ml。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述(a)的培养基中或者所述营养补充液中L-谷氨酰胺的浓度独立地为1.6-2.4mM，例如2mM。

6.权利要求1-4任一项的方法，其中所述(a)的培养基中或者所述营养补充液中丙酮酸钠的浓度独立地为0.8-1.2mM，例如1mM。

7.权利要求1-4任一项的方法，其中所述(a)的培养基中或者所述营养补充液中NAC的浓度独立地为0.8-1.2mM，例如1mM。

8.权利要求1-4任一项的方法，其中所述(a)的培养基中或者所述营养补充液中LIF的浓度独立地为8-12ng/ml，例如10ng/ml。

9.权利要求1-4任一项的方法，其中(b)的营养补充液中bFGF的浓度为80-120ng/ml，例如100ng/ml。

10.权利要求1-4任一项的方法，其中(b)的营养补充液中EGF的浓度为80-120ng/ml，例如100ng/ml。

11.权利要求1或2的方法，其中在(a)中神经干细胞在包含bFGF和EGF的培养基中培养2或3天。

12.权利要求1或2的方法，其中在(b)中添加营养补充液后继续培养2或3天后分离神经球。

13.一种组合物，其是包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mM的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mM的丙酮酸钠，0.5-1.5mM的NAC，5-30ng/ml的bFGF，5-30ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的LIF的DMEM/F12或DMEM培养基。

14.权利要求13的组合物，其中bFGF的浓度为16-24ng/ml，例如20ng/ml。

15.权利要求13的组合物，其中EGF的浓度为16-24ng/ml，例如20ng/ml。

16.一种组合物，其是包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mM的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mM的丙酮酸钠，0.5-1.5mM的NAC，50-150ng/ml的bFGF，50-150ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的LIF的DMEM/F12或DMEM培养基。