[发明专利]一种地衣芽孢杆菌菌种及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来就涉及一种地衣芽孢杆菌菌种及其在用于转化L-苏氨酸制备2,5-二甲基吡嗪方面的用途。

背景技术

2,5-二甲基吡嗪是一种常见的杂环含氮化合物，广泛存在于食品原料，加工食品和酒精饮料中，被认为是一类重要的香味化合物，具有焙烤、奶油和肉类香气，有烤焦的蛋白质气味和可可果气味，常用于调配烘焙食品、冷饮、肉类、花生、土豆、坚果、咖啡、可可等香型的食用香精，在中国酱香型白酒中含量较高。吡嗪类物质被认为是酱香型白酒中的特征物质，它们通常具有较低的风味阈值 。

L-苏氨酸是一种必需的氨基酸，L-苏氨酸主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。它可作为生物转化生成2,5-二甲基吡嗪的前体物质。

L-苏氨酸与2,5-二甲基吡嗪的化学结构：

      

2,5-二甲基吡嗪的生产方法目前主要采用的为化学合成法，一种是在铵盐存在下，由丙烯醛与氨在甘油中加热反应制得；另一种是由1,2-丙二胺和2,3-丙二醇在催化剂存在下进行缩合反应制得。然而，化学合成法普遍存在严峻的环保问题，反应条件一般较剧烈，对设备要求较高。虽然化学合成得到的吡嗪的价格远低于生物催化的价格，但消费者更倾向使用天然或生物合成的吡嗪。随着人们对绿色产品需求的日益提高，利用生物催化手段生产二甲基吡嗪具有产品绿色天然、反应条件温和、转化效率高、环境污染小等优点而广受消费者关注。目前关于生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法报道较少。

发明内容

本发明的目的在于克服上述化学合成法缺点而提供的一种反应条件温和，有害物质含量低，不受种植业的影响，可大规模生产，生产周期短的用于转化L-苏氨酸制备2,5-二甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌菌种。

本发明的另一目的在于提供该地衣芽孢杆菌菌种在用于转化L-苏氨酸制备2,5-二甲基吡嗪方面的用途。

一种地衣芽孢杆菌菌种，其细菌学特征是：菌落形态初期为突起、圆形、表面光滑有光泽，培养后期菌落边缘呈不规则状，表面扁平、淡黄色、无光泽；其16S rDNA基因序列与多株地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis) 16S rDNA的基因序列具有＞99%同源性。

该菌种已于2011年05月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号：CGMCC N_O：4825，名称为：地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)MTDB-02。

（一）地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)MTDB-02的分离步骤：

（1）取10 g茅台酒高温大曲曲粉加入装有玻璃珠的90 g无菌水(或无菌生理盐水)中，在37℃、200 rpm摇床上振荡2小时；梯度稀释涂布平板，于37℃培养48小时；从平板上挑选生长较好、性状不同菌落分别接种于肉汤琼脂斜面，作为筛选用菌株；

（2）将上面得到的筛选用菌株分别接种营养肉汤培养基中，37℃培养24小时，离心收集菌体加入50 g/L L-苏氨酸90 mL转化液，37℃、200 rpm转化24小时后，转化液采用GC-MS仪器分析2,5-二甲基吡嗪浓度，选取2,5-二甲基吡嗪产量高的菌种，得到MTDB-02，其16S rDNA基因序列与多株地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis) 16S rDNA的基因序列具有＞99%同源性。

（二）培养地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)MTDB-02的培养基：

肉汤琼脂斜面培养基：葡萄糖5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH7.0。

营养肉汤液态培养基：葡萄糖5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，水1000 mL，pH7.0。

（三）菌种的保种和传代：

菌种的保种：采用冷藏法保存﹐菌种用斜面保存﹐将菌种在培养24 h﹐用保鲜膜包好保存于冰箱。

菌种的传代：在无菌条件用接种环迅速在纯菌种表面取菌种1环﹐划线于肉汤琼脂斜面上﹐在37℃培养24 小时。每1.5个月传代一次﹐每次传代最少3支。

一种用地衣芽孢杆菌MTDB-02转化制备2,5-二甲基吡嗪的方法，包括以下步骤：