[发明专利]一种检测雌激素受体与肽酸酯配体相互作用的方法

说明书

技术领域

本发明属于检测受体与配体相互作用领域，特别涉及一种检测雌激素受体与肽酸酯配体相互作用的方法。

背景技术

肽酸酯(PAES)是一类重要的有机化合物，属环境雌激素类物质，其常见的主要有邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)和邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP)。肽酸酯类物质对人类及动物体的肝脏、生殖系统、免疫系统等具有一定的毒性作用，某些条件下对生物体还具有急性毒性作用，有研究发现肽酸酯还具有远期的生物毒理效应。有研究认为，肽酸酯类物质主要是通过与生物体内的雌激素受体发生作用，进而干扰生物体的正常机能。

表面等离子共振SPR是一种物理光学现象。其原理为：当入射光以临界角入射到两种不同透明介质(如镀在玻璃表面的金膜)界面时，可引起金属自由电子的共振，电子吸收光能量从而使反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的入射光角度即为共振角(SPR角)。SPR随金属表面的折射率变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比，因而可通过对生物反应过程中SPR角的动态变化获取生物分子相互作用的特异信号。该技术目前被广泛应用于受体-配体、抗体-抗原、免疫识别等生物分子之间的检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测雌激素受体与肽酸酯配体相互作用的方法，该方法受体与配体的结合特异性好，检出限低，可达10^-17g/L，灵敏度为10^-8ng/L，操作快捷简便，可用于研究低浓度下配体-受体的相互作用，具有良好的应用前景。

本发明的一种检测雌激素受体与肽酸酯配体相互作用的方法，包括：

(1)将喂养于含肽酸酯的水中的鲤鱼杀死并取出肝脏，用KCl溶液洗去血液，吸干水分，加入与肝脏质量体积比为1g∶4～6ml的HEDG缓冲液匀浆，离心取上清，即得含有受体的细胞溶质；

(2)使用SDS-PAGE电泳对上述含有受体的细胞溶质进行分离分析，浓缩胶中使用80～90V电压，进入分离胶后使用120～130V电压；分离分析结束后将目的蛋白条切碎，装入1mL电洗脱液，置于电泳槽中以120～130V的电压洗脱，离心取上清，即为纯化后的受体蛋白溶液；

(3)用超纯水冲洗金片，将金片放入硫酸/过氧化氢混合液中，静置，随后依次用超纯水、丙酮、超纯水、无水乙醇、超纯水冲洗金片表面，烘干；将金片置于10mmol/L的3-巯基丙酸乙醇溶液中，40℃下孵育30～40min，取出金片用乙醇(80vol％)洗涤，再用超纯水冲洗、吹干；在金片上分别滴加150μl EDC/NHS混合液和150μl 200μg/L的链霉亲和素溶液，分别于室温静置、超纯水冲洗、吹干；

(4)将经上述预处理的金片放到表面等离子共振仪上，通入PBS缓冲液，注入70μl受体，静置反应20min，再用PBS缓冲液冲洗至稳定，再依次进样不同浓度的肽酸酯溶液，得到雌激素受体-肽酸酯配体结合曲线。

所述步骤(1)中的KCl溶液浓度为0.15～0.2mol/L。

所述步骤(2)中的浓缩胶(质量百分比浓度)为5％，分离胶(质量百分比浓度)为12％。

所述步骤(3)中的静置时间为15～20min。

所述步骤(3)中的吹干采用N₂吹干。

所述步骤(4)中的肽酸酯溶液浓度分别为1×10^-17g/L、1×10^-15g/L、1×10^-13g/L、1×10^-11g/L、1×10^-9g/L、1×10^-7g/L、1×10^-5g/L。

有益效果

本发明受体与配体的结合特异性好，检出限低，可达10^-17g/L，灵敏度为10^-8ng/L，操作快捷简便，可用于研究低浓度下配体-受体的相互作用，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1的SPR检测雌激素受体-肽酸酯配体相互作用曲线。

具体实施方式