[发明专利]一种检测淀粉酶的方法和试剂盒有效
申请号: | 201110153417.8 | 申请日: | 2011-06-09 |
公开(公告)号: | CN102288559A | 公开(公告)日: | 2011-12-21 |
发明(设计)人: | 董理 | 申请(专利权)人: | 董理 |
主分类号: | G01N21/31 | 分类号: | G01N21/31 |
代理公司: | 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 | 代理人: | 逯长明 |
地址: | 130000 吉林省长春市朝*** | 国省代码: | 吉林;22 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 检测 淀粉酶 方法 试剂盒 | ||
技术领域
本发明涉及医学检验测定技术领域,具体的说是涉及一种检测淀粉酶的方法和试剂盒。
背景技术
淀粉酶(α-Amylase)简称AMS或AMY,一类能将淀粉分子水解的酶,一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1,4-葡聚糖,水解α-1,4-糖苷键,产生葡聚糖、麦芽糖和葡萄糖分子。淀粉酶在胰腺和唾液腺中含量丰富,胰淀粉酶由胰腺以活性状态排入消化道,是最重要的水解碳水化合物的酶,和唾液腺分泌的淀粉酶一样都属于α-淀粉酶。淀粉酶分子量小,可通过肾小球滤过,随尿排出。当罹患胰腺疾病或有胰腺外分泌功能障碍时可引起淀粉酶活性升高或降低,因此,测定血清和尿液中的淀粉酶对胰腺炎的诊断具有重要意义。尿淀粉酶水平波动较大,所以优选血清淀粉酶检测,或两者同时测定。
血清和尿液中淀粉酶活性的测定方法有很多种,主要有黏度测定法、比浊法、糖化法、碘-淀粉比色法、酶速率法与染料释放法等。其中,黏度测定法和比浊法由于影响因素较多,缺乏特异性和灵敏度,已被淘汰。糖化法虽然可直接测量酶活性,但操作复杂不适用于临床常规检查。目前应用较为广泛的为碘量法,酶速率法和染料释放法。其中,碘-淀粉比色法因具有成本低、检测不需要昂贵仪器、试剂稳定、操作简便、结果可靠,在临床上得到广泛应用。
碘-淀粉比色法测定血清和尿液中淀粉酶的反应原理为血清(浆)和尿液中的α-淀粉酶催化淀粉分子中α-1,4糖苷键水解,产生葡萄糖、麦芽糖及含有α-1,6糖苷键支链的糊精。在底物定量的条件下,反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物,其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较,淀粉酶活性越大,剩余淀粉越少,反应液显色越浅,将最终产物置于紫外/可见光分析仪下或半自动生化分析仪下,检测在主波长630nm处在吸光度值大小,从而测算样品中淀粉酶的含量。
然而上述方法显色剂碘液易升华挥发造成成份减少变淡影响反应显色,致使检测结果准确性降低。
发明内容
有鉴于此,本发明目的是提供一种稳定性高、准确性高的检测淀粉酶酶的试剂盒。
为实现本发明的目的,本发明采用如下技术方案:
一种检测淀粉酶的方法,包括:
步骤1、在pH7.2的缓冲液中,待测样品与可溶性淀粉混合得到混合液;
步骤2、碘化钾与酸性碘酸钾混合,与步骤1得到的混合液反应,在630nm波长下检测吸光度,根据经上述相同处理的未经酶促的空白管的吸光度,计算待测样品中淀粉酶的浓度。
血清(浆)和尿液中的α-淀粉酶催化淀粉分子中α-1,4糖苷键水解,产生葡萄糖、麦芽糖及含有α-1,6糖苷键支链的糊精。在底物定量的条件下,反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物,其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较,检测在主波长630nm处在吸光度值大小,从而测算样品中淀粉酶的含量。本发明所述检测方法以碘化钾和酸性碘化钾作为显色液,碘化钾和碘酸钾在酸性条件下生成碘,与未反应的淀粉结合形成蓝色复合物,避免直接使用碘液易升华挥发造成成份减少变淡影响反应显色,提高检测结果准确性。
优选的,所述碘酸钾与碘化钾的摩尔比为1∶5~6。
优选的,酸性碘酸钾为8~12mmol/LpH2.0~3.0的碘酸钾溶液。
为了酶与底物很好的结合,酶和底物都需要缓冲液提供适宜的解离环境。缓冲液的离子强度也影响着酶的活性,离子强度过高,电解质干扰酶和底物结合,酶活性将逐步下降,但离子强度过低也可能无法激活酶活性。一般选择与生理环境的体液比较接近的离子强度。因此本发明所述检测方法为了提供一个适宜的酶解环境,待测样品与可溶性淀粉在pH7.2的缓冲液中混合。所述在pH7.2的缓冲液包括:磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液和磷酸盐缓冲液。作为优选,本发明所述检测方法中所述pH7.2的缓冲溶液为50~100mmol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液,包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液和磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。
优选的,所述可溶性淀粉浓度为960mg/L。
本发明还提供了一种检测淀粉酶的试剂盒,包括960mg/L可溶性淀粉、50~100mmol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液、8~10mmol/LpH2.0~3.0的碘酸钾溶液和30~50mmol/L碘化钾。
优选的,本发明所述试剂盒还包括50~70mmol/L的苯甲酸钠,苯甲酸钠作为防腐剂保证试剂稳定性。
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