[发明专利]重组MSG1蛋白单克隆抗体及检测猪嗜血支原体特异性抗体的阻断ELISA方法

说明书

技术领域

本发明属于血清学领域，涉及重组MSG1蛋白单克隆抗体及检测猪嗜血支原体特异性抗体的阻断ELISA方法。 

背景技术

目前已报道的M.suis血清抗体检测的方法主要包括补体结合试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)，其中ELISA方法具有高通量、易标准化等特点，已成为常规诊断试剂的首选。检测病原抗体的ELISA方法中，单抗阻断ELISA因能够排除包被抗原中杂蛋白成分的干扰而具有良好的特异性，现今很多商品化试剂盒如猪瘟诊断试剂盒(IDEXX)、伪狂犬诊断试剂盒等(IDEXX)均是应用阻断ELISA方法，在临床上得到广泛的应用。由于猪嗜血支原体尚无成熟的体外培养方法，使抗原的来源受到限制，而利用基因工程方法表达重组蛋白将解决抗原来源困难的问题。Hozole(2007)等用猪嗜血支原体重组抗原MSG1蛋白、HspA1蛋白分别建立了间接EL ISA检测方法，并证明重组抗原ELISA的敏感性和特异性等同或高于天然抗原ELISA。猪嗜血支原体MSG1(M.suis GAPDH-like protein 1)蛋白能够介导猪嗜血支原体对宿主红细胞的粘附作用，是猪嗜血支原体感染宿主过程中的关键致病蛋白之一，该蛋白具有良好的免疫原性，可以作为单抗制备的免疫原。目前国内外还没有MSG1蛋白单抗制备的报道，也没有相关阻断ELISA检测方法建立的报道。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种一株分泌猪嗜血支原体重组MSG1蛋白单克隆抗体。 

本发明的另一目的是提供检测猪嗜血支原体特异性抗体的阻断ELISA方法。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

一株分泌猪嗜血支原体重组MSG1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A7，分类命名为鼠源单克隆杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.4860，保藏日为2011年5月13日。 

猪嗜血支原体重组MSG1蛋白的单克隆抗体anti-MSG1-1A7，该单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.4860的杂交瘤细胞株1A7分泌。 

所述的猪嗜血支原体重组MSG1蛋白单克隆抗体anti-MSG1-1A7在制备猪嗜血支原体MSG1蛋白检测试剂中的应用。 

一种检测猪嗜血支原体特异性抗体的阻断ELISA方法，将所述的猪嗜血支原体重组MSG1蛋白的单克隆抗体anti-MSG1-1A7进行HRP标记作为酶标抗体，并且判断标准如下：只有阴性对照的平均OD450大于0.5，阳性对照阻断率大于50％，该检测结果才能有效。当被检血清阻断率≤23.71％时判为血清抗体阴性反应，PI≥36.35％时判为血清抗体阳性反应，23.71％＜PI＜36.36％时判为可疑，需重复检测1次，如果仍低于36.35％则判为血清抗体阴性反应，所述的阻断率按照如下公式计算： 

阻断率＝(阴性血清OD450nm值-被检血清OD450nm值)/阴性血清OD450nm值×100％。 

所述的检测猪嗜血支原体特异性抗体的阻断ELISA方法，包括如下步骤： 

(1)在酶标板上每孔加入终浓度为0.5μg/ml的重组MSG1蛋白，4℃包被过夜，PBST洗板； 

(2)加入含5％脱脂乳的PBST，200μL/孔，37℃2h封闭，PBST洗板； 

(3)加入1∶1稀释的待检血清样品，100μL/孔，设标准阴性血清对照和标准阳性血清对照，37℃1h，PBST洗板； 

(4)加入1∶10000稀释的酶标单抗HRP-MAb，100μL/孔，37℃1h，PBST洗板； 

(5)加入TMB底物溶液，100μL/孔，37℃10min。加入2mol/L的H₂SO₄ 50μL/孔终止反应，用酶标仪读取各孔OD450nm值，计算阻断率，进行结果判断： 

阻断率＝(阴性血清OD450nm值-被检血清OD450nm值)/阴性血清OD450nm值×100％， 

判断标准如下：当阻断率≤23.71％时判为血清抗体阳性反应，PI≥36.35％时判为血清抗体阴性反应，23.71％＜PI＜36.36％时判为可疑，需重复检测1次，如果仍低于36.35％则判为血清抗体阴性反应。 

其中，所述的重组MSG1蛋白序列为SEQ ID NO.1。 

所述的重组MSG1蛋白通过基因工程方法得到，其制备、纯化和鉴定方法详见实施例1。