[发明专利]隐孢子虫病毒衣壳蛋白抗体ELISA检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明提供一种隐孢子虫病毒衣壳蛋白抗体ELISA 检测方法及试剂盒，用于动物及人隐孢子虫感染血清抗体的检测，本发明还公开了上述ELISA试剂盒的制备方法，属于血清学检测技术领域。

背景技术

隐孢子虫是普遍存在的胃肠道寄生性原虫，能引起人类与家畜的腹泻。含有隐孢子虫卵囊的人类、家畜、宠物和野生动物的粪便，直接威胁着人类饮用水安全，导致隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）。分子流行病学研究结果显示出大多数人隐孢子虫病是由人隐孢子虫和微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum,C.parvum genotype II) 引起的。目前，还没有有效的方法治疗人的隐孢子虫感染。而现行的诊断方法直接镜检和染色镜检法费时、费力、检出率低；间接荧光抗体试验和PCR 方法对仪器设备和试剂的要求较高，因此建立一种快速、特异性较高且可直接判定结果的诊断方法是十分必要的。

隐孢子虫病毒（Cryptosporidium parvum virus，Cryspovirus，CSpV）是1997年Khramtsov 在牛犊中分离出来的C.parvum卵囊中发现的，该病毒含有含长的dsRNA (L-dsRNA)和短的 dsRNA(S-dsRNA)，其中S-dsRNA 编码病毒衣壳蛋白。之后，Khramtsov 又发现所有C.hominis和C.parvum都含此dsRNA 病毒，而Cryptosporidium其他种中不存在。因此可以把CSpV的分子特征和抗原特性作为检测C.hominis和C.parvum卵囊的一个依据。而该病毒衣壳蛋白基因S-dsRNA 就可作为对人具有感染性的隐孢子虫（C.hominis和C.parvum）与其它种类隐孢子虫鉴别的一个分子标记和含病毒虫株的分离和鉴定的依据。

目前尚无利用抗隐孢子虫病毒检测感染动物血清中抗体的报道。

发明内容

本发明公开了一种隐孢子虫病毒衣壳蛋白血清中抗体ELISA 检测试剂盒，解决了当前粪便检测灵敏度低、费时、费力的缺点，能检测感染人的隐孢子虫。

本发明还提供了上述ELISA检测试剂盒的制备方法，利用在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达的S-dsRNA 蛋白作为抗原，建立了检测人的隐孢子虫感染血清中抗体的间接ELISA 方法。

本发明的隐孢子虫病毒衣壳蛋白血清中抗体ELISA 检测方法，其特征在于：抗原为隐孢子虫病毒衣壳重组蛋白，用于检测血清中隐孢子虫病毒抗体。

本发明的隐孢子虫病毒衣壳蛋白抗体间接ELISA 检测试剂盒，组成包括：隐孢子虫病毒标准阳性血清、隐孢子虫病毒标准阴性血清、酶标二抗、包被病毒衣壳蛋白的酶标板、底物显色液、洗涤液、终止液、封闭液和酶标物稀释液及样品稀释液。

上试剂盒的制备方法，其特征在于：以隐孢子虫病毒衣壳蛋白为抗原包被于酶标板，隐孢子虫病毒蛋白标准阳性血清和标准阴性血清、底物显色液、洗涤液、终止液、酶标物稀释液、样品稀释液和封闭液，组成ELISA试剂盒。

所述抗原为隐孢子虫病毒衣壳重组蛋白。

本发明ELISA试剂盒检测方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理：将被检血清用样品稀释液1∶200稀释；

（2）用本发明的ELISA试剂盒检测，向包被隐孢子虫病毒衣壳重组蛋白的酶标板孔中加入封闭液，再加入血清，孵育60分钟，洗涤液洗涤，加入酶标二抗，孵育60分钟，洗涤液洗涤，加入显色液孵育10分钟，终止液终止反应，用酶标仪测定吸光度值；

（3）分析检测结果：

当OD490nm≧0.32时，样品判定为阳性；当OD490nm﹤0.268时，样品判定为阴性。

本发明的积极效果在于：检测的样品为血清，检测特异性高、灵敏度高、稳定性好，能检测人隐孢子虫的感染，适合于临床的快速诊断和基层、农村等流行病学调查大规模应用。

附图说明

图1为重组蛋白的纯化SDS-PAGE电泳图；

图中：M: 低分子量蛋白标志物；1: 纯化的重组蛋白；M：DL 2000 Marker；lane1：the protein purfied。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。

实施例1

隐孢子虫病毒衣壳蛋白CSpV表达

1 材料和方法