[发明专利]一种使用人工染色体重组技术培育心血管系统荧光转换斑马鱼的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种细菌人工染色体的重组工程技术，及应用其构建心血管系统带有蓝色荧光并可转换为黄色荧光的转基因斑马鱼模型的方法。

背景技术

心脏是人体的第一个发育的器官，是所有生命活动的能量供给动力中心。它通过大血管，微血管和血液构建的循环系统脉冲式的压迫血流将氧气和营养供给组织和器官，同时带走代谢产物。心血管疾病是死亡率最高的疾病，每年大约有30%的死亡与之有关。内皮细胞是心血管的最内层的细胞，具有多种合成和代谢功能，包括调节血栓及其溶解，血小板黏附，调控血管节律和血流，通过控制白细胞，单核细胞和淋巴细胞调节免疫和炎症反应。内皮细胞的损伤，会导致动脉粥样硬化和心肌梗死等多种致命心血管疾病。血管内皮生长因子(VEGF)受体flk广泛分布在整个心血管内皮系统，对于模式动物斑马鱼心血管系统flk基因进行荧光标记，可以方便的观察研究心血管病理进程。Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。基于Cre-loxP系统的荧光转换功能可以对相关基因在心血管的表达进行监控，揭示基因与疾病的关系。

     细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome, BAC）是一种基于细菌质粒的系统，被广泛应用于基因组测序及图谱绘制，疾病基因的定点克隆，近来开始被用于转基因动物的建立。相对于其他克隆系统而言，BAC系统有着很强的可操作性及应用优势。BAC携带了完整的基因表达启动子及相应调控元件，对构建高精度转基因斑马鱼系及其他转基因动物有着极其重要的意义。BAC系统可以被看作一个较大的质粒，与所有分子遗传学的常规技术兼容。通过重组工程菌SW105进行BAC重组, 方便准确的修饰BAC。这种工程菌提供了Exo, Beta和 Gam3种功能，Gam保护导入的线性DNA免遭RecBCD酶切，Exo提供了5’到3’核酸外切活性，Beta与被外切后的单链DNA结合，提供保护。

本发明融合了人工染色体重组，Cre-loxP系统等多种技术，通过技术优化，提高了效率，构建了高精度的心血管系统荧光转换斑马鱼，为后基因组时代心血管疾病与基因功能研究及应用提供了有效工具。 

发明内容

发明目的

本发明提供一种构建心血管系统带有蓝色荧光并可转换为黄色荧光的转基因斑马鱼模型的方法。

技术方案

一种使用人工染色体重组技术培育心血管系统荧光转换斑马鱼的方法，其特征在如下步骤实现：

A、flk BAC导入工程菌SW105，其中flk BAC为CH211-231B5；

B、采用目的片段5’引物 ：5’-CATACGAGTATCATTCGGGGTTATTTTAACAG ACAAAATTAATTCAGACGCGCAAGTTTGTACAAAAAAGAGGCT-3’  和

目的片段3’引物 ：5’-ATAACACAAAAAGCGACACTTACCATGTGAAA TACAACGGCTAGTCTTTCCAGAGTAGTGAGGAG-3’ 扩增pPCRBloxYkanFrt中的荧光转换基因元件；

C、荧光转换基因元件的电击导入含flk-BAC感受态细胞，并大量培养；

D、清除插入基因片段所带筛选抗性；

E、引入Tol/ISceI转座位点提高整合效率：其中Tol/ISceI插入位点1引物:

上游引物：5‘-ACCCAATTCACCTGTAGCGCATGGACTAGAGATGAAGCTTGG TACCGAGCTCGGATCCACTAGTACGGC-3’

下游引物：5‘-GATCTGCAGCATATCATGCGTGTAATATGAGAGACGAGCTC GGATCCGAACAAACGACCC-3’

Tol/ISceI插入位点2引物:

上游引物：5‘-GGGCATCGGTGAGCTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCG AGCGGCCG CCAGTGTGATGG-3’

下游引物：5‘-CTGTTCCTGCGCCCGAAGAGTCTTGTGGTAAGTTTGTGCAGG CGGCCGCATTCCC-3’；

F、斑马鱼胚胎的注射；

G、潜在的成功转基因鱼筛选。