[发明专利]杂交瘤细胞株2C9、其产生的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株2C9、其产生的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素B1的毒性最强，它的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。黄曲霉毒素M1（AFM1）是AFB1的羟基化代谢产物，哺乳动物摄入AFB1污染的饲料后，在体内经羟基化会分泌于乳汁当中。通常当动物摄入了AFB1污染的食物后，AFM1的排出量为AFB1摄入量的1%～3%。大量的研究者对AFM1的毒性和致癌性进行了深入的研究，研究结果也促使国际癌症研究机构将AFM1的致癌等级由二类致癌物质变为一类致癌物质。AFM1性质稳定，即使经过巴氏杀菌，也几乎完全不能被破坏。在许多乳制品中均含有AFM1。由于乳制品是婴幼儿食物的主要来源，因此AFM1污染问题引起了世界各国的广泛关注，并对AFM1进行了严格的限量。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区，因此加强乳及乳制品中黄曲霉毒素M1的检测、特别是速测，及时了解和掌握乳及乳制品的卫生信息，对保障我国食品消费安全具有重要意义。

现有黄曲霉毒素的检测方法包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中薄层层析法是检测黄曲霉毒素最常用的检测方法，其不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近些年发展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，所以要研究建立针对黄曲霉毒素M1的任何一种免疫学检测技术，都必须先制得抗黄曲霉毒素M1的抗体。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株2C9、其产生的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体及其应用。

本发明提供了杂交瘤细胞株2C9，该细胞株已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO. C201018。其具有序列表中SEQ Gene No.1所示的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ Gene No.2所示的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。

抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞株2C9分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ Protein No.1所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ Protein No.2所示的氨基酸序列。该抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体可以识别黄曲霉毒素M1，对黄曲霉毒素M1的50%抑制浓度IC₅₀ 为67 pg/mL。

抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体在黄曲霉毒素M1测定中的应用。

本发明提供的杂交瘤细胞株2C9是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为：将BALB/c小鼠经黄曲霉毒素完全抗原AFM1-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的黄曲霉毒素完全抗原AFM1-BSA作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素M1作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株2C9。

本发明提供的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株2C9注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化即得抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体。