[发明专利]一种神经干细胞冻存复苏的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种神经干细胞冻存复苏的方法。本发明通过添加EGF和bFGF两种细胞因子，使得神经干细胞冻存复苏率大大提高，由现有技术中的40％左右达到90％以上，本发明对神经干细胞成功地进行了冻存、复苏，对临床择期进行干细胞移植手术和建立“干细胞库”具有重要的意义。

背景技术

神经干细胞(Neural Stem Cell，NSC)是存在于胚胎或成体脑、脊髓等组织中的一种干细胞，是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，可通过不对等的分裂方式分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等神经组织的各类细胞，也可转分化成血细胞和骨骼肌细胞。在脑、脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。目前的科学技术已经可以在体外培养扩增神经干细胞，用于生命科学研究、药物筛选测试、临床应用研究等领域。由于神经干细胞冻存后复苏率直接影响着神经干细胞的质和量，为获得来源方便的神经干细胞，改进神经干细胞冻存复苏技术、建立一种能够长期储存干细胞的方法对促进神经干细胞的研究和应用具有重要意义。

目前，神经干细胞冻存使用的冻存液有含血清和无血清的两类，由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，无血清冻存和复苏技术成为发展趋势。目前神经干细胞无血清冻存液的主要成分是70％的无血清培养基、20％牛血清白蛋白(BSA)和10％二甲基亚砜(DMSO)。

冻存程序一般是梯度降温的方法，降温速度大约是1℃/分钟。

对冻存的细胞进行复苏时，一般是将冻存管直接置于37℃迅速解冻，然后加入完全生长培养基重悬细胞，离心弃上清后，再加入完全生长培养基继续培养，以供后续的研究或测试使用。

结合上述无血清冻存和复苏技术对神经干细胞进行冻存和复苏，冻存后复苏率仅有40％左右，远低于含血清的冻存技术。

因此，本领域需要新的对神经干细胞进行冻存和复苏的方法，以提高神经干细胞的冻存复苏率，从而获得优质的神经干细胞冻存复苏产品，为以后神经干细胞移植手术和建立“干细胞库”等应用奠定良好的基础。

发明内容

本发明涉及一种神经干细胞冻存复苏的方法，该方法对冻存液、复苏液、冻存程序、复苏程序等进行了改进和优化，使神经干细胞的复苏率相对于现有技术的方法大大提高，从现有技术所获得的40％左右的复苏率提高到90％以上。

具体地，本发明的神经干细胞冻存复苏方法包括以下步骤：冻存步骤、复苏步骤和洗涤步骤，其中冻存步骤包括向神经干细胞悬液中加入冻存液和在液氮中冻存的步骤；复苏步骤包括向从液氮中取出的冻存细胞中加入复苏液使细胞复苏的步骤；洗涤步骤包括将复苏的细胞液洗涤后制备成细胞悬液备用。

本发明在传统的冻存液配方中添加了生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。所述EGF在冻存液中的终浓度为0.008-0.04μg/ml、优选0.009-0.03μg/ml，最优选0.01-0.02μg/ml；所述bEGF在冻存液中的终浓度为0.008-0.04μg/ml、优选0.009-0.03μg/ml，最优选0.01-0.02μg/ml。

在一个具体实施方案中，所述冻存液为DMEM或DMEM/F12培养液中包含：1×B27添加剂，1×N2添加剂，L-谷氨酰胺，终浓度为1.6-2.4mM，丙酮酸钠，终浓度为0.8-1.2mM，N-乙酰半胱氨酸(NAC)，终浓度0.8-1.2mM，EGF(表皮生长因子)，终浓度0.005-0.04μg/ml、优选0.008-0.03μg/ml，最优选0.01-0.02μg/ml，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，终浓度0.005-0.04μg/ml、优选0.008-0.03μg/ml，最优选0.01-0.02μg/ml，二甲基亚砜(DMSO)，终浓度7-8％(v/v)，牛血清白蛋白(BSA)，终浓度0.08-0.12g/ml。上述DMEM培养液、DMEM/F12培养液、B27添加剂和N2添加剂是培养神经干细胞的常用公知添加剂，购自Invitrogen公司，它们也可以从其它商业渠道购买得到。在配制过程中，将上述B27添加剂(Invitrogen，50倍浓度(50×))、N2添加剂(Invitrogen，100倍浓度(100×))加入DMEM或DMEM/F12培养液(Invitrogen，1倍浓度(1×))中，使B27添加剂、N2添加剂的终浓度分别为0.8×-1.2×浓度，优选Invitrogen公司建议使用的1倍浓度B27添加剂(1×B27添加剂)终浓度和1倍浓度N2添加剂(1×N2添加剂)终浓度。