[发明专利]一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种三维类心肌组织的制备方法。

背景技术

外太空环境具有微重力、超低温、高真空和强辐射等特征，其中，微重力对人体生理功能有明显影响。国内外航天医学研究者进行了大量微重力对人体机能影响的医学观察和研究，发现长时间太空飞行可引起生理机能出现一定程度的病理学改变，主要包括心血管系统、肌肉系统、免疫系统和骨骼系统的病理性改变。由于心血管系统维持着人体的正常生命活动，因此研究微重力对人体心血管系统的影响，探讨其机理及制定有效防护措施，对于保证航天员在太空飞行时的健康和有效工作具有重要意义。

目前研究微重力效应的心肌细胞模型主要是通过在回转器中培养细胞，从而达到定性模拟微重力环境。心肌细胞的三维培养方法是目前用于研究模拟微重力效应最广泛的细胞培养方法，使心肌细胞生长在cytodex微载体的表面。这种方法存在许多不足：(1)cytodex微载体材料具有毒性，会对细胞产生不利影响；(2)培养时需要的细胞量大，收取细胞困难；(3)在回转器中培养时，易受气泡等因素产生的剪切力的干扰；(4)心肌细胞的持续收缩时间短。

发明内容

本发明是要解决目前用于研究模拟微重力效应的细胞三维培养方法中cytodex微载体材料具有毒性而对心肌细胞产生不利影响，培养时需要的细胞量大，收取细胞困难，细胞在回转器中培养时易受剪切力的干扰，心肌细胞的持续收缩时间短的问题，提供一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织微球的制备方法。

本发明的一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法，按以下步骤进行：一、将质量浓度为0.05％～3％的海藻酸钠溶液与质量浓度为10％～50％的I型胶原蛋白溶液混合，得到混合溶液；二、将出生后1～3d的Wistar大鼠乳鼠心脏置于0～4℃的0.1mol/L的PBS溶液中，然后用0～4℃的0.1mol/L的PBS溶液清洗心脏3～5次，再将心脏组织剪成1～3mm³大小的组织块，再用0～4℃的0.1mol/L的PBS溶液清洗3～5次，然后将组织块用消化液消化10～30min，再加入组织块10倍体积的DMEM培养基，离心后弃上清，然后向沉淀中加入DMEM培养基制成细胞悬液A，将细胞悬液A接种到培养瓶中，差速贴壁90～120min，得到纯化的心肌细胞；三、将纯化的心肌细胞与步骤一制得的混合溶液混合，制成细胞密度为0.5×10⁶～5×10⁶个/mL的心肌细胞悬液，采用针头将心肌细胞悬液逐滴加入到25～100mmol/L的二价阳性离子溶液中，静置5～20min，得到包裹心肌细胞的微球；四、将包裹心肌细胞的微球加入质量浓度为0.1％～3％的海藻酸钠溶液中静置5～20min后，再放入质量浓度为0.5～2％的多聚赖氨酸溶液中静置5～20min，然后将经过静置的包裹心肌细胞的微球放于DMEM培养基进行三维培养1～2周，即形成具有持续搏动功能的三维类心肌组织；其中步骤一中I型胶原蛋白溶液的质量是海藻酸钠溶液质量的0.1％～50％；步骤二中消化液由胰酶和胶原酶II组成，消化液中胰酶的质量浓度为0.02～0.2％，胶原酶II的质量浓度为0.01～0.1％；步骤二中消化液的体积为组织块体积的9～12倍；步骤二和步骤四中的DMEM培养基中都含质量浓度为10％～15％的胎牛血清；步骤二中的细胞悬液A的细胞密度为0.5×10⁶～5×10⁶个/mL；步骤三中的二价阳离子溶液中二价阳离子为钙离子、钡离子或锶离子；步骤四中海藻酸钠溶液的体积为微球体积的9～12倍，多聚赖氨酸溶液的体积为微球体积的9～12倍。

本发明采用组织工程技术在体外构建具有心肌结构和功能的类心肌组织，该类心肌组织具有与真实的心脏组织十分相近的特点而且便于精确调控，利用这样的类心肌组织来代替心肌细胞用于研究模拟失重条件下的心肌结构和功能改变的分子生物学机制，搭建一个适用于空间生命科学研究和空间环境风险评价的三维心肌细胞培养平台。

本发明的方法具有以下优点：

1、心肌细胞在微球内较少受到剪切力干扰；

2、心肌细胞在微球内形成球状细胞团，在生物学性能上与在体组织更为接近；

3、微球具有一定的孔隙率，心肌细胞在微球内既能接受营养物质又能将代谢废物排出；

4、心肌细胞在微球内可长期培养，无需传代，更适于空间搭载；