[发明专利]产道诺菌素和阿霉素的假单胞工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种产道诺菌素和阿霉素的假单胞工程菌。 

背景技术

道诺霉素和阿霉素为蒽环类抗生素，是联合国世界卫生组织(WHO)推荐的治疗肿瘤化疗的基本药物。道诺菌素又名柔红霉素，1963年由Dimarco首次发现，它具有抗革兰氏阳性菌、抗革兰氏阴性菌、肿瘤及病毒的作用，还具有免疫抑制性。阿霉素又名14-羟柔红霉素，是道诺菌素结构中道诺糖胺的4′位羟基化衍生物。 

道诺霉素和阿霉素在临床上主要用于急性淋巴细胞或粒细胞白血病、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤等疾病的治疗，对各种实体瘤、脑瘤、血管瘤等也有不同程度的缓解作用。 

道诺霉素和阿霉素可由链霉菌Streptomyces peucetius ATCC29050发酵产生，阿霉素生物合成基因簇负责道诺霉素和阿霉素的生物合成。而采用S.peucetius ATCC 29050进行道诺霉素和阿霉素的生产存在一些不足，例如菌体生长速度慢(菌体的倍增时间近48小时)、难培养(需严格的富含氧气的环境，且需充分搅拌以使菌体混匀)以及遗传育种较难进行(菌株为革兰氏阳性菌，有一层厚厚的细胞壁，诱变剂难以发挥功效)等。这些因素制约着对道诺霉素和阿霉素的有效开发和应用。近年来，次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达成为提高化合物产量或有针对性地改造化合物的有效手段。 

在异源表达宿主的选择中，由于假单胞菌与抗生素主要来源的放线菌密码子的使用相近，有翻译后修饰，安全无毒(如模式菌株恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440)，生长快速，次级代谢产物背 景清晰等优点，成为首选的宿主菌之一。在其中进行生物合成基因簇的异源表达有着很好的应用潜力。 

发明内容

本发明的目的是提供一种产道诺菌素和阿霉素的假单胞工程菌。 

本发明的另一目的是提供上述假单胞工程菌在生产道诺菌素和阿霉素中的应用。 

为了实现本发明目的，本发明的一种产道诺菌素和阿霉素的假单胞工程菌，其是将阿霉素生物合成基因簇中移码缺失的TDP-D-葡萄糖4，6-脱水酶基因中的dnrM置换为doxE，然后将改造后的基因簇整合至恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440的基因组中而获得。 

前述的工程菌，其中所述阿霉素生物合成基因簇来源于链霉菌(Streptomyces peucetius)ATCC 29050。 

前述的工程菌，改造后的基因簇是与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440的基因组中的。 

前述的工程菌，其是将改造的阿霉素生物合成基因簇与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌KT2440基因组中trpE基因和trpC之间的区域而获得。 

前述的工程菌，所述筛选标记基因为卡那霉素抗性基因或庆大霉素抗性基因。 

前述的工程菌，其是将改造的阿霉素生物合成基因簇与卡那霉素抗性基因一起整合至恶臭假单胞菌KT2440基因组中trpE基因和trpC之间的区域而获得。 

前述的工程菌，其为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)Sino-DNDR，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路中科院微生物研究所，保藏号CGMCC NO.4637，保藏日期2011年3月7日。该工程菌的培养方法为：将所述工程菌接种于LB培养基中，在30℃下进行培养。 

本发明还提供上述工程菌在生产道诺菌素和阿霉素中的应用，其是将所述的工程菌进行发酵培养，然后从发酵液中分离纯化得到目标 产物道诺菌素和阿霉素。 

本发明通过基因工程的方法，将来源于链霉菌(Streptomycespeucetius)ATCC 29050的阿霉素生物合成基因簇中移码缺失的TDP-D-葡萄糖4，6-脱水酶基因中的dnrM置换为doxE后，与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440的基因组中，构建得到产道诺菌素和阿霉素的假单胞工程菌。其中，对恶臭假单胞菌Sino-DNDR进行发酵，发酵产物经高效液相色谱(HPLC)检测表明：道诺菌素和阿霉素的产量分别为3.01μg/ml和2.34μg/ml。所得菌株还可通过优化发酵条件及目标化合物的分离和纯化步骤等进一步地提高道诺菌素和阿霉素的产量，达到大规模工业化生产的目的，因此本发明有着广泛的应用价值。 

附图说明