[发明专利]一种采用竞争法检测他克莫司血药浓度的方法

说明书

技术领域

本发明属于检测他克莫司领域，特别涉及一种采用竞争法检测他克莫司血药浓度的方法。

背景技术

他克莫司(Tacrolimus)又名FK506，是从链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)中分离的发酵产物，其化学结构属23元大环内酯类抗生素。为一种强效的新型免疫抑制剂，主要通过抑制白介素-2(L-2)的释放，全面抑制T淋巴细胞的作用，较环孢素强100倍。近年来，作为肝、肾移植的一线用药，已在日本、美国等14个国家上市。临床实验表明，其在心、肺、肠、骨髓等移植中应用有很好的疗效。同时FK506在治疗特应性皮炎(AD)、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性眼病等自身免疫性疾病中也发挥着积极的作用。

但是，服用他克莫司由胃肠道吸收的变异性大，在每个病人体内的吸收率和清除率差别较大。如果剂量不足，机体可能会排异移植器官，但如果剂量过大，血药浓度高会产生一定的毒性，损害神经系统及肾脏等其他器官，并增加感染的机会，因此，定期测定血药浓度以调整用药剂量非常必要，通过测定他克莫司的血药浓度并比较肝功能的变化可以了解所服用药物剂量是否正确。肝移植术后理想的他克莫司血药浓度为：术后一个月内8-15纳克/毫升，1-3个月为8-12纳克/毫升，4-6个月为5-10纳克/毫升，7个月以后为4-8纳克/毫升，其后维持他克莫司4-8纳克/毫升的血药浓度水平也各不相同。总之，血药浓度只是作为一个参考指标，最终还是要由主治医生结合临床疗效和不良反应来调整药物剂量。

目前测定他克莫司血药浓度的常用方法主要有：高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)和微粒子酶免疫测定法等。ELISA最为常用，其方法简便，准确性和敏感性较高，检测底限可达0.3纳克/毫升，但是分析速度较慢。

Luminex xMAP技术，又称流式荧光技术，又称悬浮阵列、液态芯片，该技术的核心是把直径为5.6um的聚苯乙烯小球用荧光染色的方法进行编码，通过调节两种荧光染料的不同配比获得最多可达100种具有不同特征荧光谱的微球，然后将每种编码微球共价交联上针对特定检测物的抗原、抗体或核酸探针等捕获分子。应用时，先把针对不同检测物的编码微球混合，再加入微量待检样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的捕获分子发生特异性结合，在一个反应孔内可以同时完成多达100种不同的检测反应。最后用Luminex^TM100进行分析，仪器通过两束激光分别识别微球的编码和检测微球上报告分子的荧光强度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种采用竞争法检测他克莫司血药浓度的方法，该方法操作简单，测定速度快，样品用量少，成本低，灵敏度以及线性范围比ELISA法更高更宽，具有良好的应用前景。

本发明的一种采用竞争法检测他克莫司血药浓度的方法，包括：

在磁珠表面耦联上他克莫司，在样品孔中加入经抗凝稀释的血浆样品，加入荧光素标记的他克莫司单克隆抗体，经过洗脱，在激发光激发下测定荧光强度，即得他克莫司血药浓度。

所述抗凝所用抗凝剂为乙二胺四乙酸，稀释倍数为4～6倍。

所述荧光素为PE。

所述激发光波长为530nm。

本发明原理：基于luminex XMAP技术平台，检测样品中的游离药物与他克莫司磁珠竞争结合荧光素标记的他克莫司单抗，导致荧光强度下降，荧光强度与游离药物浓度成反比。

有益效果

本发明操作简单，测定速度快，样品用量少，成本低，灵敏度以及线性范围比ELISA法更高更宽，具有良好的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)将血浆样品用EDTA抗凝，并稀释4倍；

(2)超声波处理磁珠，用清水洗净，耦联上他克莫司；

(3)在luminex仪的样品孔中加入经抗凝稀释的血浆样品；

(4)加入PE标记的他克莫司单克隆抗体，经过洗脱，在530nm波长的激发光激发下，测定荧光强度。

实施例2

(1)将血浆样品用EDTA抗凝，并稀释6倍；

(2)超声波处理磁珠，用清水洗净，耦联上他克莫司；

(3)在luminex仪的样品孔中加入经抗凝稀释的血浆样品；

(4)加入PE标记的他克莫司单克隆抗体，经过洗脱，在530nm波长的激发光激发下，测定荧光强度。