[发明专利]核仁磷酸蛋白可变剪接体的质谱鉴定方法和胃癌诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物样品的检测领域，特别涉及突变蛋白的质谱学鉴定方法。

背景技术

核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPM、B23、N038或NPM1)是位于核仁颗粒区的主要蛋白分子之一，人类B23基因位于染色体5q35，基因全长约23kb(Chan，P.K.，1986，Zhang，X.X，1989；Cochrane，A.W，1990)，包含有12个外显子，编码由294个氨基酸组成的蛋白质。在正常情况下核仁磷酸蛋白主要位于核仁颗粒区，但是可以穿梭于核仁、核质和胞质而发挥重要作用(Charles G，2008)。

核仁磷酸蛋白的12个外显子(Exon1-12)序列分别如下：

目前公认的B23基因有两个转录剪接体。B23蛋白最早于1989年由Chen W-Y等报道，该基因及蛋白序列也就是被认为野生型，实际上是跳过10号外显子编码294氨基酸残基的版本；Dalenc F于2002年报道了另一个剪接体，即保留10号外显子但在10号外显子末终止，也就是把11、12号外显子切除，这个剪接体共编码259个氨基酸残基；这两个版本表明，B23基因mRNA成熟过程中在10号外显子处存在一个选择机制，即要么把10号外显子剪切掉，要么在10号外显子末终止。

B23基因在所有类型的组织细胞中广泛表达，但在增殖活跃的细胞包括肿瘤细胞和干细胞中高表达。但在血液细胞恶性增殖的疾病中，B23表达并不高，而是发生了大量的基因突变和重排。

在白血病中，B23基因展现了两种突变，即参与基因重排和B23基因自身突变。前者最常见为B23与其它基因(RARa、MLF1、ALK)形成致癌性的融合蛋白，促进急性早幼粒细胞白血病(M3)、骨髓增生异常综合征(MDS)和淋巴瘤的发生。后者即B23自身基因突变则要复杂一些。

在实体瘤的研究中发现，B23基因通常表现为过表达，产生大量的B23蛋白。Yun J-P等检测了103例肝细胞癌(hepatocellular careinoma，HCC)，12例肝局灶性结节状增生(hepatic focal nodular hyperplasia)，17例肝血管瘤(hepatic haemangioma)旁肝脏组织和正常人器官等，发现HCC中B23的表达要比非恶性肝细胞多得多(1ncreased expression of nucleophosmin/B23inhepatocellular carcinoma and correlation with clinicopathological parameters.Br JCancer.2007Feb 12；96(3)：477-84).。但是，在实体瘤研究中，还没有任何关于B23基因突变以及可变剪接体的研究和报道。

本发明人首次发现了实体瘤(具体为胃癌)样本中B23基因转录本出现突变，进一步研究发现，在胃癌样本中存在一种典型的跳过8号外显子的剪接体B23-T和大量散在突变，同时通过细胞实验证明上述可变剪接体B23-T与野生型B23蛋白的功能不同，可导致细胞多核，因此该可变剪接体B23-T可以作为临床诊断的指标使用。

在对突变的检测中，通常会用到核酸水平的检测。但是，一方面，混杂在大量正常样本中的少量异常样本的检测并不容易，另一方面，核酸水平的检测并不能代替蛋白水平的直接检测。

检测与野生型蛋白不一样的剪接体蛋白，通常的方法是开发一个能特异识别突变位点的抗体，通过特异的抗原-抗体反应来达到区分野生型蛋白/突变蛋白的目的。但是，得到这样一种具备区分度的抗体，不仅费时费力，而且还不一定能够筛选得到。具体来说，特异性抗体的一般筛选方法是通过设计突变位点附近的多肽序列并通过该多肽免疫获得多抗血清或者筛选相应的单抗；或者直接用整个突变蛋白免疫小鼠，通过杂交瘤技术得到多株单克隆抗体。这些抗体都需要再通过与两种蛋白(野生型和突变型)进行抗原-抗体反应如ELISA，来鉴别这些抗体中哪些可以在与两种蛋白反应时有差别，其差别是否达到能明显区分的程度，而且不会产生假阳性的信号。理想的抗体是对突变型蛋白有阳性反应，但是对于野生型蛋白完全没有反应的抗体。从理论推理来说，做到这一点是困难的；而从实践来说，对初步试验合格的抗体，即对野生型蛋白和突变型蛋白具有一定区分度的抗体，由于初步筛选时一般使用纯的野生型或突变型蛋白进行试验，因此需要对初步合格抗体进行其他蛋白的干扰试验，这也增加了最终获得合格抗体的难度。