[发明专利]一种海洋贝类D形幼虫的石蜡切片方法

说明书

技术领域

本发明属幼虫的石蜡切片领域，特别是涉及一种海洋贝类D形幼虫的石蜡切片方法。

背景技术

石蜡切片技术是组织胚胎学的重要研究手段之一，其技术手段成熟稳定，且具有组织胚胎结构完整、所获得的图像清晰，反差强烈等特点，可在普通光学显微镜下清晰地看到组织胚胎外部形态和内部结构，具有不同于压片、冰冻切片和电镜的独特优势。石蜡切片技术已被广泛应用于鱼类及哺乳动物胚胎及幼体的组织胚胎学及细胞学研究中。

由于多数海洋贝类从D形幼虫起，幼虫表面开始覆盖一层钙质的幼体壳，手工无法剥离，并且多数贝类的胚胎及幼虫个体微小，壳长一般一百多微米，如栉孔扇贝D形幼虫壳长为90～130μm，青蛤D形幼虫壳长为140～190μm，幼虫体积小，肉眼不容易分辨，这些都给脱水、透明、浸蜡、包埋等过程带来很大不便。

海洋贝类幼虫的壳长、壳宽和壳高并不一致，包埋时应对幼虫进行定位，以方便切片时能对幼虫进行纵切和横切，以便更好的观察研究海洋贝类幼虫的内部细胞、组织及器官结构，系统地研究海洋贝类幼虫各个发育阶段内部细胞、组织及器官的发生、发育，为海洋贝类早期胚胎及幼虫发育机理的深入研究和贝类遗传育种提供基础资料。但是，传统的石蜡切片技术尚未解决上述诸多困难，所以，目前尚未有用石蜡切片技术来研究双壳贝类幼虫发育过程的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种海洋贝类D形幼虫(壳顶期幼虫、稚贝)的石蜡切片方法，该方法简单易行，毋需增加仪器设备，可对直径≥60μm的大多数海洋贝类的幼虫进行石蜡切片，处理时间短，完好地保存幼虫组织的原有形态及结构，为贝类早期胚胎及幼虫发育研究提供了切实有效的技术手段。

本发明的一种海洋贝类D形幼虫(壳顶期幼虫、稚贝)的石蜡切片方法，包括：

(1)将Bouin氏液加入存有海洋贝类D形幼虫样品的容器中，充分摇匀，待样品沉降后，更换Bouin氏液，1-2小时更换一次，直至气泡消失，Bouin氏液固定12小时后，移入质量百分比浓度70％酒精中，更换酒精直至完全洗去样品中的黄色，得到固定后的海洋贝类D形幼虫；其中Bouin氏液与样品的体积比为10∶1～50∶1；酒精与样品的体积比为10∶1～50∶1；

(2)用500目或300目筛绢将上述固定后的海洋贝类D形幼虫包裹，放置于包埋盒中，包埋盒经过脱水步骤，透明步骤和浸蜡步骤；

(3)将经过步骤(2)处理后的筛绢打开，放置在温度为50-60℃的铁质台上，将操作区周围的环境温度调至40-45℃，用吸管吸取融化后温度为65～70℃的石蜡，将样品冲散后吸入管内，将吸管内的样品注入盛满融化石蜡的铁质包埋盒底部，待样品沉降后在体式显微镜下用解剖针将样品调整到最佳位置，室温冷却包埋块；

(4)将上述包埋块切片，切片厚度5～7μm，蜡带用40℃-50℃恒温水浴展片，贴于事先涂有粘片剂的载玻片上，然后烘烤；

(5)染色采用苏木精-伊红复染方法，步骤如下：二甲苯脱蜡5分钟3次、体积比1∶1的无水乙醇/二甲苯3分钟、95％乙醇3分钟、80％乙醇3分钟、70％乙醇3分钟、50％乙醇3分钟、30％乙醇3分钟、蒸馏水3分钟、苏木精染液2～3分钟、自来水冲洗10～15分钟、30％酸性乙醇分色(显微镜下控制至合适的颜色)、自来水冲洗10～15分钟复蓝，至细胞核呈蓝色(或者在碱性自来水中浸洗3分钟后流水浸洗3分钟)、30％乙醇3分钟、50％乙醇3分钟、70％乙醇3分钟、80％乙醇3分钟、95％乙醇3分钟、伊红染液45秒～1分钟、95％乙醇分色(显微镜下控制至合适的颜色)、无水乙醇3分钟2次、体积比1∶1的无水乙醇/二甲苯3分钟、二甲苯5分钟2次；之后用中性树胶封片，烘烤即得；上述溶液的浓度均为质量百分比浓度。

所述步骤(1)中的海洋贝类D形幼虫样品采用目数为500目或300目的筛绢网对幼虫进行收集，充分排出多余的海水后将幼虫放置于容器的底部；其中500目聚乙烯筛绢的孔径为25μm，300目聚乙烯筛绢的孔径为48μm。

所述步骤(1)中的Bouin氏液配方为：苦味酸饱和液、甲醛和冰醋酸的混合液，三者的体积比为：15∶5∶1，其中苦味酸饱和液用盐度为30‰消毒海水配制。

所述步骤(2)中的脱水步骤具体为：70％乙醇脱水1小时、80％乙醇脱水30分钟2次、95％乙醇脱水15分钟2次和无水乙醇脱水15分钟2次，其中所述溶液的浓度均为质量百分比浓度。

所述步骤(2)中的透明步骤具体为：用体积比1∶1的无水乙醇/二甲苯过渡处理30分钟，再用二甲苯透明15分钟2次。