[发明专利]一种麒麟菜属海藻原生质体分离培养和再生植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种藻类培养方法，具体涉及一种麒麟菜属海藻原生质体分离培养和再生植株的方法。

背景技术

麒麟菜属海藻的自然繁育主要是通过四分孢子囊和果孢子囊的方式进行繁育。目前，在麒麟菜属海藻养殖生产中，主要是采用切段再生的方式进行栽培养殖。但由于这种方式占用水体面积大，且夏季藻体因水温过高、降水量大导致盐度过低等环境影响，苗种繁育生产不稳定。另外，麒麟菜属海藻体壁具有较厚的胶质层，无法直接应用电转化等遗传转化技术进行品种的改良。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种育苗周期短、苗种繁育效率高的麒麟菜属海藻的培养方法，它能够解决麒麟菜属海藻苗种保种和繁育的问题，可用于生产性育苗。

一种麒麟菜属海藻原生质体分离培养和再生植株的方法，其主要是根据海藻体细胞发育的全能性，利用海藻工具酶分解麒麟菜组织，游离出体细胞原生质体，获得再生细胞壁的体细胞和细胞系，然后将其培养得到再生植株。具体步骤如下：

（1）利用海洋贝类提取纯化制得海藻工具酶，然后加入渗透剂；

（2）将麒麟菜研磨或剪切成细小的组织块或小的分枝，浸没在海藻工具酶溶液中消化，获得麒麟菜体细胞原生质；

（3）将原生质体培养得到再生细胞壁的细胞，进一步培养即可得到再生植株。

所述的海洋贝类为鲍。

所述渗透剂为甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、KCl、NaCl中的一种。

所述步骤（3）中原生质体的培养条件为：采用PES培养基配成培养液，温度20℃下黑暗培养3-4天，转为光照培养，光照时间为12h/d，光强1500-2000lx，定期更换培养液。

本发明利用体细胞原生质体直接进行育苗，无须培育麒麟菜生殖成熟的藻体；体细胞原生质体再生细胞壁转化为体细胞，相对于有性生殖育苗技术，无须生殖细胞的有性生殖过程，缩短了育苗周期；并且苗种繁育效率高，适合于大规模育苗生产。

附图说明

图1是麒麟菜原生质体的荧光检测图（×10倍）。

图2是麒麟菜原生质体埃文斯蓝染色结果。

其中，箭头1所示为活细胞，染色结果显示亮黄色；箭头2所示为死细胞，染色结果显示深蓝色。

图3是麒麟菜原生质体培养各阶段图。

其中，（a）培养5d；（b）培养15d；（c）培养22d；（d）培养37d。

图4是培养22天时麒麟菜细胞的荧光检测图。

其中，（a）为荧光检测前；（b）为荧光检测后。

具体实施方式

下面结合附图通过具体实施例进一步说明本发明。

本实施例实验材料为麒麟菜（Eucheuma denticulatum）。

1．原生质体分离方法

取1-2克麒麟菜，将其研磨或剪切成细小的组织块或小的分枝，利用海洋贝类（鲍）消化腺提取纯化，按照生物化学纯化蛋白质（酶）的方法制成海藻工具酶，添加2 M 的葡萄糖作为渗透剂，在20-25℃下，将细小的组织块或小的分枝浸没在海藻工具酶溶液中2-3个小时，期间用玻璃棒进行搅拌。用300目筛绢过滤细胞混合液，除去未消化的细胞、细胞团、碎片；取上清液离心，800rpm离心10min，使单细胞（原生质体）下沉，细胞碎片留在上清液中，弃去上清液，用高渗消毒海水（分别含有1mol/L，O.5mol/L葡萄糖）反复冲洗、离心、弃上清液等过程2-3次，即获得较为纯净的麒麟菜体细胞原生质体悬液。

2．原生质体鉴定方法

采用0.1%的荧光增白剂染色法对所得细胞进行了鉴定。首先采用0.1%的荧光增白剂对所得样品进行染色5min，于荧光显微镜镜下观察，激发光波长为370nm紫外光，如图1所示检测显示为红色。这是因为有壁细胞会有蓝绿色荧光显示纤维素存在，原生质体无蓝绿色荧光，其由于叶绿体的存在而发红色荧光，显示无纤维素的存在。

用血球计数板统计原生质体数量，统计不同酶解时间下其产量和平均成活率，见表1和表2。

 

表1 不同酶解时间下原生质体产量