[发明专利]使用2-甲基吡啶硼烷作为还原剂还原胺化和分析糖类

说明书

本发明涉及糖类（carbohydrate）的还原胺化。

蛋白偶联聚糖涉及到重要的生物过程，例如细胞间相互作用、受体活化和分子运输(Ohtsubo等人，Cell 2006,126,855-67)。最近的关于聚糖在药物治疗中的作用的研究和聚糖作为特异性疾病中的生物标志物的研究引起了对快速和灵敏的高通量糖分析方法（glycoanalytical method）的需求(Packer等人，Proteomics 2008,8,8-20；和Wuhrer,M.Expert.Rev.Proteomics 2007,4,135-36)。

这些方法包括HPLC（Royle等人，Anal.Biochem.2008,376,1-12；和Ruhaak等人，Anal.Chem.2008,80,6119-26）和与UV检测、荧光检测或质谱检测相结合的毛细管电泳（CE）（Kamoda等人，J.Chromatogr.A 2006,1133,332-39）。可供选择地，质谱分析法可以用作独立的技术（Qian等人，Anal.Biochem.2007,364,8-18；和Jang-Lee等人，Methods Enzymol.2006,415,59-86）。许多方法涉及用于引进紫外吸收或荧光标签的聚糖衍生化（Anumula,K.R.Anal.Biochem.2006,350,1-23；和Shilova等人，Bioorg.Khim.2003,29,339-55）。

在说明书中列出或讨论的先前公布的文件或任何背景不应必然地被认为是承认文件或背景是现有技术的部分或者是公知常识。

广泛使用的标记技术涉及通过还原胺化使寡糖与胺取代的发色团或荧光团偶联。在可逆反应中，开环形式的糖类与胺基反应并消除水，形成希夫碱。在第二不可逆反应中，希夫碱被还原形成仲胺。在该反应中最广泛使用的还原剂是氰基硼氢化钠（NaBH₃CN）。该试剂的主要缺点是，水解时其容易形成有毒的挥发性化合物氰化氢。该试剂另一个缺点是，其被认为是过于强烈的还原剂，导致寡糖的至少一些直接还原而不是还原胺化。

对于糖类与4-氨基-N-[2-(二乙氨基)乙基]苯甲酰胺（DEAEAB）的还原胺化，引入了可选的还原剂三乙酰氧基硼氢化钠（NaBH(OAc)₃）并且假定该方法适合于所有的胺标记（Dalpathado等人，Anal.Bioanal.Chem.2005,381,1130-37）。然而，该还原剂没有广泛地应用于聚糖分析。这被认为是由于其反应不足。

本发明通过提供2-甲基吡啶硼烷（2-picoline borane，2-PB）用于糖类的还原胺化的用途论述了以上和其他的缺点。出人意料地，发明人发现2-PB作为糖类标记的还原胺化试剂特别有效和有用。因此，本发明还提供了标记糖类的工艺，所述工艺包括：在2-PB的存在下，将糖类与标记剂接触，生成标记的糖类。

在不受理论束缚的情况下，认为2-PB用于糖类的还原胺化（例如，标记）的用途具有以下意想不到的优点：

（i）与NaBH₃CN相比，糖类的还原胺化如果没有改进，则具有可比较的转化和/或选择性；和/或

（ii）与NaBH(OAc)₃相比，糖类的还原胺化具有改进的转化和选择性；和/或

（iii）与NaBH₃CN相比降低的毒性。

在优选的实施方案中，将糖类与标记剂在2-PB的存在下反应。任何适合的标记剂均可以用于本发明。通常，标记剂将包括可以与开环形式的糖类还原末端反应的胺基。实例包括：胺取代的发色团或荧光团和其他含有标记剂的胺，例如丙氨酸和[¹³C₆]-丙氨酸。目前胺取代的发色团或荧光团是优选的标记剂。

适合的胺取代的发色团或荧光团的实例包括2-氨基苯甲酸（2-AA）、2-氨基苯甲酰胺（2-AB）、8-氨基芘-1,3,6-三磺酸（APTS）、2-氨基吡啶（2-AP）、[D₆]-AP和[D₄]-2-AA。氨基取代的发色团或荧光团可以携带进一步的反应性官能团。此种多官能标签的实例包括2,5-二氨基吡啶和2-氨基-6-酰氨基生物素基吡啶（BAP）。目前，2-AA、2-AB和APTS是优选的胺取代的发色团或荧光团（例如APTS）。其他适合的胺取代的发色团或荧光团对于技术人员来说是明显的，例如来自Anumula,K.R.Anal.Biochem.2006,350,1-23，将其引入本文作为参考。