[发明专利]新的流感病毒

说明书

本发明提供了新的流感病毒，所述病毒中NS和PB1基因节段均经过改造，并且PB1-F2 ORF被导入了至少一个终止密码子。根据特定实施方案，所述流感病毒缺少功能性NS1和PB1-F2蛋白，在干扰素活性细胞(interferon competent cells)中是复制缺陷的。

此外，提供了包含所述改造的流感病毒的疫苗制剂及其预防流感感染的用途。

发明背景

A型流感病毒是威胁人和动物的最常见病原体之一，甚至可能引起灾难性的大流行。A型流感病毒每年在世界范围内造成300,000-500,000例死亡，在大流行的年份中，这个数字可能增加到1百万(1957-1958年)或者可能象1918-1919年发生的情况，高达5千万。近年，关于高致病性的禽流感病毒(H5N1)造成大流行的可能性已引起人们的极大关注。1997年香港发生了人体H5N1感染的一次小规模爆发，造成18人被感染和6例死亡，至今共计383例人感染事件，而死亡率达到61％。

已在欧洲获得批准的灭活流感疫苗仅有有限的保护效果，特别是对于老年群体和还未经历过天然流感的幼童来说。冷适应活流感疫苗能够更有效地用于儿童的疾病预防和控制疾病传播，但当前可以利用诸如反向遗传学的新技术来进一步改善活疫苗方法。

目前的减毒活疫苗的概念基于产生适应在25℃生长(冷适应)的温度敏感的、减毒的“主毒株(master strain)”。冷适应活病毒疫苗和灭活病毒疫苗以不同方式刺激免疫系统，但这两种情况中，缺乏足够的免疫原性是流感疫苗接种的最重要的缺点之一，尤其是对于老年人。

尽管ca活流感病毒疫苗被认为是足够安全的，减毒的确切遗传和分子机制并未被彻底理解。冷适应流感疫苗的安全属性据称是基于散布在内部基因区段上的大量点突变之上的。但只有少数通过作图定位到聚合酶基因内的突变可以造成那些不能在正常体温复制的冷适应病毒株的弱化(Herlocher，M.L.，A.C.Clavo，and H.F.Maassab.1996，Virus Res.42：11-25；Herlocher，M.L.，H.F.et al.，1993，Proc Natl Acad Sci U S A.90：6032-6036)。事实上，活疫苗株的遗传稳定性受到了诸多质疑，因为从接种了疫苗的宿主体内重新分离得到的病毒显示出额外的点突变，而这些点突变可能最终发挥出“抑制”突变的作用，造成回复病毒的复制性能加强并可能丧失温度敏感的表现型(Herlocher，M.L.，H.F.et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.90：6032-6036，Treanor，J.，M.et al.，1994 J Virol.68：7684-7688.)。

对流感遗传学的新认识给构建用于活疫苗的理想免疫株提供了指导，其中可能通过靶向遗传工程将全部的主要致病因子去除。A型流感病毒含有分节段的负链RNA基因组(Lamb & Krug，1996)。8个节段编码转录酶复合体(PB1、PB2、PA、核蛋白NP)、三个整合膜蛋白(凝血素HA、神经氨酸苷酶NA、蛋白通道M2)、基质蛋白(M1)、核输出蛋白(NS2/NEP)和非结构性多功能致病因子NS1的亚基。

已证实，显示缺失NS1蛋白，由于在干扰素感受态(interferon competent)细胞或生物体中不能复制(复制缺陷表现型)会导致流感病毒的毒力明显减弱。缺少NS1蛋白的病毒不能拮抗被感染的细胞产生的细胞因子，因此诱发自体佐剂化(self-adjuvanting)和免疫调节效应。用DelNS1病毒进行免疫后的免疫反应特征是引发与优势IgG2A同种型抗体反应相关的Th1型免疫反应(B.Ferko et al.2002)。

据报道存在由节段2的替代ORF编码的第11个蛋白(Chen et al.，2001)。这个促细胞凋亡蛋白能够与线粒体蛋白ANT3(腺嘌呤核苷酸转运蛋白3)和VDAC1(电压依赖性阴离子通道1)相互作用，被认为是重要的致病因子。在被感染的宿主免疫细胞中观察到了PB1-F2诱发的细胞类型依赖性细胞死亡，而表皮细胞中未见到这一现象。有可能病毒致病性的提高是由于被感染免疫细胞的凋亡造成了免疫反应的延迟。据估计在病毒复制的初期，PB1-F2的功能损害了诸如巨噬细胞和树突细胞的专职抗原递呈细胞递呈抗原的能力。