[发明专利]同型二聚体形式的PLGF-1

说明书

技术领域

本申请涉及PlGF的新型同型二聚体形式，其特征在于在其C-端区存在一个链间二硫键。本申请还涉及其生产和纯化方法、包含其的组合物及其作为药物或化妆品的用途。本申请还涉及其它目的，将通过描述变得清楚。

背景技术

胎盘生长因子(PlGF)是血管内皮生长因子(VEGF)家族的成员，并通过经由VEGF受体-1的信号作为血管生成放大因子(amplifier)发挥作用，其主要由血管内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞表达，也由人CD34+骨髓重建干细胞(marrow repopulating stem cell)表达。

PlGF以至少四种剪接异构体PlGF-1至PlGF-4存在，其在大小和结合特性上不同。

PlGF-1完整的肽和核苷酸序列在专利申请WO 92/06194中已有描述。

详细来说，PlGF-1序列含有位于35、60、66、69、70、77、111、113和125的九个半胱氨酸残基，是形成链内-和链间-二硫键的潜在候选。半胱氨酸残基的上述编号对应着大肠杆菌(Escherichia coli)产生的重组PlGF-1，其包括天然PlGF-1中不存在的N-端甲硫氨酸(例如：重组PlGF-1中的Cys³⁵对应着天然PlGF-1-也作PlGF₁₃₁中的Cys³⁴)。

通过以分辨率的PlGF-1晶体结构分析已经证实了二硫键的存在(Iyer S.等人，J.Biol.Chem.，2001，276，12153-12161)。根据Iyer等人，PlGF-1描述为通过Cys⁶⁰-Cys⁶⁹Cys⁶⁹-Cys⁶⁰之间的两个链间二硫键以及Cys³⁵-Cys⁷⁷、Cys⁶⁶-Cys¹¹¹和Cys⁷⁰-Cys¹¹³之间的三个链内二硫键共价结合的、以反平行排列组织的同型二聚体分子。

通过晶体学分析证明的最有关的特征是存在半胱氨酸-结基序(cysteine-knot motif)。位点114之后，PlGF-1的C-端序列不显示有组织的结构，通过推测，还未确定有关的晶体结构。

然而，同型二聚体中位点125的两个半胱氨酸残基之间存在的距离，致使这两个位点之间不可能存在链间共价键，因为这要求分子扭曲。

同型二聚体形式已显示是PlGF的生物活性形式，而PlGF单体是无活性的。

一些研究已证明PlGF-1的药理活性。

例如，初步观察已显示出在对5-氟尿嘧啶-抑制小鼠中的早期和晚期骨髓造血作用上以及对干细胞/祖细胞动员至血流中，通过表达hPLGF(人胎盘生长因子)的腺病毒载体获得的积极作用。

此外，已显示PlGF-1体内诱导血管生成以及体外刺激内皮细胞迁移和增殖(Ziche M.等人，Lab.Invest.，1997，76，517-531)。PlGF蛋白质或基因治疗对缺血性疾病的有益作用已在例如WO-A-01/56593和US-2007/0027100中公开。缺血性疾病包括脑缺血、急性心肌梗塞和下肢缺血。

通过参考并入此处的专利申请WO-A-03/066676描述了从遗传修饰的细菌细胞中提取和纯化重组PlGF-1的方法。获得的产物，此后称作[DIM1/2]PlGF-1，包括至少98.5％的二聚体和多聚体活性形式，至少70％的二聚体形式和1.5％以内无活性的单体形式。

根据本方法，PlGF-1通过重组DNA技术在E.coli中以包涵体表达。然后，通过在变性缓冲液中溶解包涵体来提取，在氧化还原作用系统存在下重新折叠，随后通过两步色谱程序(阴离子交换色谱，随后是反相色谱)纯化。

尽管WO-A-03/066676中公开的方法获得的PlGF-1蛋白质是高纯活性形式，本发明人已发现这种产物在水溶液中不表现出最佳稳定性，有时显示出批-批的不均匀性(通过质谱、SDS-PAGE和IEF分析)。

WO-A-03/097688公开了制备PlGF-1分子突变蛋白质的方法，其中PlGF-1分子位点125的半胱氨酸被不能形成二硫键的不同氨基酸所置换。

上述突变蛋白质在水溶液中显示比野生-型PlGF-1更好的稳定性。

本发明的范围是提供活性PLGF的新型稳定形式。