[发明专利]表皮生长因子受体(EGFR)与蛋白酶活化受体2(PAR2)对肠道通透性的调节

说明书

联邦基金注释

本发明自国立卫生研究院获得的基金(基金号DK048373)在政府支持下完成。政府对此发明具有一定权利。

相关申请的交叉索引

根据U.S.C.35第119(e)条，本国际专利申请案要求享有2009年6月10日归档的现已终止的美国临时专利申请第61/185,662号的优先权，并且上述专利申请案的内容以引用的方式合并于此。

发明背景

发明领域

本发明涉及细胞生物学和肠道通透性领域。更为具体地，本发明涉及表皮生长因子受体(EGFR)与蛋白酶活化受体2(PAR2)对肠道通透性的调节。

相关技术描述

卫生水平的提高而导致的与各种微生物接触的减少，被认为是过去三四十年里工业化国家中，造成有记录的过敏、炎症和自身免疫症等流行病的原因之一(1)。除了遗传体征和与环境因素的接触外，第三类重要因素，例如增加的肠道通透性(IP)，被认为是这些疾病的致病原因(2-4)。

肠道通透性与肠上皮细胞和肠内腔树突状细胞进行的抗原摄取共同调节肠腔与黏膜下层间的分子运输，导致对非自体抗原的免疫或耐受(5)。然而，胞旁空间的尺寸(10到15埃)表明分子半径大于15埃(分子量约3.5kDa，包括蛋白质)的溶质通常被排阻在这种摄取途径之外。细胞间紧密连接严密地调节这种胞旁抗原运输。

紧密连接是在生理和病理环境下都对肠上皮的多种重要功能有操控作用的动态结构(3)。然而，尽管对于细胞间紧密连接组成和功能上的了解有了很大进展，其调控机理尚不完全清楚。

一种能够增加紧密连接通透性的毒素——霍乱弧菌闭合带毒素(Zot)的发现，导致了对于其真核细胞对应物——连蛋白(zonulin)的确认。zonulin是已知的唯一一种能够通过调节细胞间紧密连接来可逆地调控小肠通透性的调节物(6，7)。人zonulin是约为47kDa的蛋白，能够增加非人灵长目动物肠上皮的肠道通透性(7)，参与肠道天然免疫(8)，并在紧密连接功能障碍居核心地位的自身免疫紊乱疾病，如乳糜泻(CD)(9，10)和一型糖尿病(11)中，高量表达。

触珠蛋白是一种急性时相反应蛋白，主要在肝脏、动脉壁、子宫内膜和腹膜合成。触珠蛋白的核心功能是作为血红蛋白(Hb)的结合蛋白，参与大部分在肝脏网状内皮系统中的，游离血红蛋白的终末过程和清除。该系统使血红蛋白基元中的铁得以保持。

触珠蛋白具有由二硫键连接的两条α-链和两条β-链组成的四聚体结构。β-链(245个氨基酸)的分子量约为40kDa(约30％的质量为糖类)，为所有表现型所共有。α-链存在两种形式：α-1(83个氨基酸，9kDa)和α-2(142个氨基酸，17.3kDa)。因此触珠蛋白具有三种表现型：Hp1-1，Hp2-1和Hp2-2。Hp1-1包含两条α-1链，Hp2-2包含两条α-2链，Hp2-1包含一条α-1链和一条α-2链。Hp1-1的分子量为100kDa，与血红蛋白结合时分子量为165kDa。Hp1-1以单体异构体存在，也被称为Hp二体。Hp2-1的平均分子量为220kDa，形成线性多聚体。Hp2-2的平均分子量为400kDa，形成环状多聚体。每种不同的多聚体形态均为一种不同的异构体。

触珠蛋白作为一种潜在治疗手段可用于溶血造成的肾脏损害。治疗上的潜在作用主要表现于作为一种清除游离血红蛋白的手段，其形成的复合物还具有潜在的抗炎症、抗氧化及血管生成剂的作用。然而，触珠蛋白被认为难于在保持其生物活性的同时进行大规模分离。

对于触珠蛋白前体2功能的阐释以及其调节肠道通透性的方法有着广泛的需求。本发明将填补这些方面的长期空白。

发明概述

虽然zonulin在健康和疾病中作为肠道通透性调节物的角色已有了功能性的描述，但其生化特性尚不清楚。本发明显示，通过对人血清的蛋白质组分析，zonulin等同于触珠蛋白前体2(HP2)。该分子先前只被认为是触珠蛋白的无活性前体，与HP1一样，是人触珠蛋白前体的两种遗传突变体之一。本发明展示了作为触珠蛋白前体2的zonulin的功能性描述。其作为一个多功能蛋白，以完整的单链前体形式，通过蛋白酶活化受体2(PAR2)的活化，反式激活表皮生长因子受体(EGFR)，来调节肠道通透性，而且被剪切后的双链形式则作为血红蛋白的清道夫。

因此，在本发明的一部分实施例中，提供了治疗一种自身免疫疾病的方法，由增加跨表皮细胞电阻，以导致细胞通透性减少的步骤组成。