[发明专利]用于检测调节VFT域膜蛋白二聚体的化合物的方法

权利要求书

1.用于选择对存在于测量介质中的细胞膜内表达的VFT域蛋白二聚体的活化状态具有调节作用的化合物的方法，所述二聚体由第一蛋白和第二蛋白组成，所述蛋白相同或不同，其中该方法包括下列步骤：

(a)用FRET配偶体对的成员在所述第一蛋白和第二蛋白VFT域的N端部分标记所述第一蛋白和第二蛋白；

(b)在不存在及存在测试化合物的情况下，激发所述FRET配偶体并测量FRET信号；

(c)在不存在及存在测试化合物的情况下，如果在步骤(b)中测量到FRET信号的差别，选择该测试化合物作为调节化合物；

在步骤(b)中，所述FRET信号是在这样的时窗中测量的：在该时窗内，存在及不存在参比激动剂或拮抗剂化合物时测量到的信号是不同的。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中测量的信号是以激发后180-800μs的延迟及从200μs到1000μs的积分时间完成的。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

(i)所述FRET配偶体对的半径(R₀)在之间，步骤(b)中测量的信号是以激发后20-100μs的延迟及从100μs到500μs的积分时间测量的；或者

(ii)所述配偶体对的半径(R₀)大于步骤(b)中测量的信号是以激发后180-800μs的延迟及从200μs到1000μs的积分时间测量的。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，存在及不存在测试化合物时的FRET测量是在存在所述二聚体的已知激动剂的情况下完成的。

5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述第一蛋白和第二蛋白为含有VFT域的C类G-蛋白偶联受体。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述VFT域蛋白二聚体选自：促代谢型谷氨酸受体、γ-氨基丁酸受体、与甜味知觉相关的受体、与鲜味知觉相关的受体、胞外钙敏感受体和碱性氨基酸受体。

7.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述VFT域蛋白二聚体为促代谢型谷氨酸受体或选自TAS1R2-TAS1R3或TAS1R1-TAS1R3。

8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，用FRET配偶体对的成员对所述第一蛋白和所述第二蛋白进行的标记是通过结合配偶体对间接标记或者通过共价键合直接标记。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一蛋白和所述第二蛋白各自以与自杀酶融合的融合蛋白形式表达，其特征还在于，所述第一蛋白和所述第二蛋白的标记是通过向测量介质添加所述FRET配偶体对成员完成，所述FRET配偶体对的各成员共价键合至所述自杀酶的底物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一蛋白和所述第二蛋白各自以与不同自杀酶融合的融合蛋白形式表达。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一蛋白和所述第二蛋白各自以与相同自杀酶融合的融合蛋白形式表达。

12.如权利要求9-11任一项所述的方法，其特征在于，所述自杀酶选自：酰基载体蛋白的片段、O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶突变体或脱卤素酶突变体。

13.如权利要求1-12任一项所述的方法，其特征在于，所述FRET配偶体对由选自下述组中的荧光供体化合物和受体荧光化合物组成：

(i)首先，所述荧光供体化合物选自：铕螯合物、铽螯合物、铕穴状化合物和铽穴状化合物；

(ii)其次，所述受体荧光化合物为选自下列物质的荧光有机分子：罗丹明、花青苷、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硝基苯并噁二唑、青色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色和红色荧光蛋白及在远红外范围发荧光的蛋白。