[发明专利]用于纯化靶物多肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于纯化靶物分子的方法，包括下述步骤：(a)将靶物分子，和靶物结合多肽(TBP)的群体，在溶液中接触充足时间以允许复合物形成；和(b)通过后续纯化步骤从来自(a)的复合物分离靶物。

背景技术

治疗蛋白质的回收和纯化占据生物药物大约75％的生产成本。在纯化步骤中增加效率和/或减少成本受广泛关注。一般的工业纯化工艺通常包括多个单元操作步骤，如提取，沉淀，以及阳离子和阴离子交换层析。由于其高回收率、得率和特异性，亲和层析是优选的下游工艺步骤，但目前亲和层析的成本和限制非常巨大，且多种情况下对于更加一般和有效的使用该单元操作而言是高到无法承受的(prohibitive)。

常规亲和层析通常以具有固定于固体相基质的捕捉配体为特征。该配体可逆地结合存在于流体如液体培养基或血清中的靶物分子。靶物分子通过在洗脱条件解离复合物来回收。商业上可获得的亲和基质为随时可用(ready to use)的形式，包含共价附着于基质的捕捉配体。在常规亲和层析中，配体和靶物蛋白之间的解离常数K_D是在约10^-5至10^-7M的范围。具有超过10^-10至10^-11M的解离常数的相互作用通常无法使用，因为此时解离该复合物所需的条件与导致靶物蛋白变性的条件相同。

在共同未决的申请WO 2009062942中，我们之前说明了在纯化工艺中应用固定于基质的通用的捕捉配体，和分别对靶物生物分子和捕捉配体具有不同结合亲和力的半通用的双重亲和多肽的可行性。所述双重亲和多肽(DAP)与靶物生物分子反应生成中等结合亲和力(medium binding affinity)的1∶1复合物，其中一个DAP结合于一个靶物，且该复合物随后非共价结合于具有强结合亲和力的通用亲和基质。靶物分子通过从所述通用基质的特异性洗脱来回收，留下所述双重亲和多肽附着于基质上的捕捉配体，这是由于对配体的紧密结合防止其从固相基质的泄漏。

本发明的目标是通过增加DAP分子的结合能力来进一步改善该系统。

发明内容

本发明提供了改善的用于使用靶物多肽(TBP)纯化靶物分子的方法，所述靶物多肽如DAP分子具有双重结合亲和力；一个针对所述靶物分子，而另一个针对固体支持物。本发明的TBP相对于DAP有所改善，因为TBP能够与靶物分子形成更高阶的复合物(higher order complex)，由此得到增加的结合效率。

在第一个方面，本发明涉及用于纯化靶物分子的方法，包括下述步骤：(a)将靶物分子和靶物结合多肽(TBP)的群体在溶液中接触充足时间以允许复合物形成；和(b)通过后续纯化步骤从来自(a)的复合物分离所述靶物，其中(i)所述靶物结合多肽具有至少两个结合官能度；第一个结合官能度针对靶物，而第二个结合官能度针对包含于固体支持物中的捕捉配体；和(ii)所述第一结合官能度包含至少两个针对靶物的结合位点，且所述靶物包含至少两个针对TBP的结合位点。

在第二个方面，本发明涉及能够测量复合物形成的测定法在优化特异性TBP-靶物组合的结合能力中的用途。

在第三个方面，本发明涉及用于纯化靶物分子的TBP，其中(i)所述靶物结合多肽具有至少两个结合官能度；第一个结合官能度针对所述靶物，而第二个结合官能度针对包含于支持物中的捕捉配体；和(ii)所述第一结合官能度包含至少两个针对靶物的结合位点。

在第四个方面，本发明涉及用于优化复合物形成的试剂盒，包含适当的TBP和用于去除TBP的支持材料。

在第五个方面，本发明涉及用于选择适于与所需靶物多肽形成复合物的TBP的方法，包括(a)将从TBP文库可获得的单个TBP与所需靶物相接触，和(b)确定复合物形成。

附图说明

图1显示了总结制备的缀合物相对于浓度、化学计量、反应时间和测得的每蛋白A的SPDP取代的程度的表。

A列：在SPDP活化过程中以mg/ml计的蛋白A浓度

B列：每蛋白A的SPDP当量

C列：每蛋白A的SPDP取代程度

D列：在SMCC活化过程中以mg/ml计的亲和素(avidin)浓度

E列：每亲和素的SMCC当量

F列：在相互缀合过程中蛋白A和亲和素之间的摩尔比

G列：在相互缀合过程中以mg/ml计的蛋白A浓度

H列：以分钟计的相互缀合反应时间