[发明专利]碱性蛋白酶变体

说明书

技术领域

本发明涉及碱性蛋白酶变体，其为可混合到液体洗涤剂中的有用酶，以及涉及编码该碱性蛋白酶变体的基因。

背景技术

长久以来，蛋白酶被用于大量工业产品，包括洗涤剂(例如，衣物洗涤剂)、纤维改良剂(fiber-modifying agent)、皮革处理剂、化妆品、洗浴剂、食品改良剂和药物。其中，工业上最大量生产的是用于洗涤剂的蛋白酶。迄今已知的该类蛋白酶的例子包括Alcalase、Savinase(Novozymes)、Maxacal(Genencor)、Blap(Henkel)和KAP(Kao Corporation)。

将蛋白酶混合到衣物洗涤剂中以赋予该洗涤剂将主要由蛋白质构成且沉积在衣物上的污渍降解成低分子量产物的能力，从而通过表面活性剂促进该降解产物的溶解性。然而，实际上，该沉积的污渍是包括除蛋白质以外的很多例如皮脂来源的脂质和固体颗粒的有机和无机成分的复合污渍。因此，对于能对这样的复合污渍表现出极佳清洁力的洗涤剂一直有持续的需求。

考虑到上述课题，本发明人之前发现数个具有大约43,000分子量的碱性蛋白酶，其甚至在高浓度脂肪酸的存在下都能保持充分的酪蛋白降解活性，且表现出对于含有蛋白质和皮脂的复合污渍的极佳清洁力；并且发明人之前提交了关于碱性蛋白酶的专利申请(专利文献1)。这些碱性蛋白酶和传统已知的枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)在分子量、初级结构和酶学特征方面不同，其中，该传统已知的枯草杆菌蛋白酶是从属于芽孢杆菌属的细菌中得到的并且对氧化剂具有极强抗性的丝氨酸蛋白酶。建议将这些碱性蛋白酶分类到新的枯草杆菌蛋白酶亚族中(非专利文献1)。

同时，洗涤剂可按照其形态而分为粉末洗涤剂和液体洗涤剂。有利地，液体洗涤剂比粉末洗涤剂具有更高的溶解性，且其原液可以直接施用到污渍上。虽然液体洗涤剂具有粉末洗涤剂所不具有的优点，但公知液体洗涤剂在加入例如蛋白酶这样的酶时的稳定性方面遇到技术难题，而粉末洗涤剂没有该问题。一般而言，因为液体洗涤剂储藏在室温中，酶(蛋白质)容易变性。此外，液体洗涤剂含有表面活性剂、脂肪酸、溶剂等，且其pH落于弱碱性范围内。如此的条件对于酶而言是非常严苛的。而且，作为蛋白水解酶的蛋白酶所经历的自我消化非常成问题，进一步降低了酶在液体洗涤剂中的储存稳定性。

为了解决如上所述的技术问题，已公知添加酶稳定剂，例如钙离子、硼砂、硼酸、硼化合物、羧酸(例如，蚁酸)、或多元醇。已经进行了一些以抑制蛋白酶活性为基础的研究来解决自消化问题。具体地，已经报道了通过使用4-取代苯基硼酸(专利文献2)或某种肽醛和硼组合物(专利文献3)对蛋白酶活性进行可逆抑制来稳定蛋白酶的方法。也报道了经葡聚糖修饰的蛋白酶可增强蛋白酶在包含表面活性剂的水溶液中的稳定性(非专利文献2)。

然而，由于酶稳定剂(例如，钙离子或硼酸)的添加而产生的蛋白酶稳定作用是不充足的，且抑制效果依据蛋白酶的类型而不同。而且，该制剂的使用增加了生产成本。因此，不认为该对策是是解决液体洗涤剂相关问题的最好方案。酶的化学修饰也造成生产成本方面的问题。

一般地，液体洗涤剂中添加有表面活性剂、碱剂、抗-再沉积剂、溶剂、香料、荧光染料等。在这些添加物中，表面活性剂最严重地破坏了酶稳定性。典型地，阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂会一起使用。虽然非离子表面活性剂不会在很大程度上对酶造成损伤，却认为阴离子表面活性剂在很大程度上损伤酶，因为阴离子表面活性剂通过其疏水部分进入酶并且破坏酶的疏水相互作用，并捕集稳定酶的二价金属离子(例如，钙离子)(非专利文献3)。因此，酶对阴离子表面活性剂的抗性的增加是对增强酶在液体洗涤剂中的稳定性的非常重要的因素。

在源自于KP43[芽孢杆菌属KSM-KP43(FERM BP-6532)]的碱性蛋白酶中，已知其相对于母碱性蛋白酶活性的特定活性通过如下方式来增强：用组氨酸残基取代在氨基酸序列位点15的氨基酸残基；用苏氨酸或谷氨酰胺残基取代氨基酸序列位点16的氨基酸残基(专利文献4)；用脯氨酸残基取代在氨基酸序列位点65的氨基酸残基(专利文献5)；或者用天冬氨酸残基取代氨基酸序列位点66的氨基酸残基(专利文献6)。然而，对于能够增强源自于KP43的碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的稳定性而不减少特异活性的碱性蛋白酶变体还是未知的。

专利文献1：WO 99/18218小册子

专利文献2：JP-A-H11-507680

专利文献3：JP-A-2000-506933

专利文献4：JP-A-2004-305176